擬南芥ERD15基因缺失突變體的分子鑒定和表型分析

熊慧, 呂桂珍, 李冬兵, 李韶山

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

植物的形態(tài)、生理和生化反應(yīng)由一系列基因控制，這些基因的表達(dá)會(huì)受到多種因素的誘導(dǎo)，包括病菌、干旱、高鹽、寒冷等。根據(jù)基因的表達(dá)模式和對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)，可以分為不同類別，即冷誘導(dǎo)響應(yīng)基因COR、低溫響應(yīng)基因LTI和脫水誘導(dǎo)早期響應(yīng)基因ERD等[1]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)受脫水脅迫1 h內(nèi)可誘導(dǎo)ERD基因表達(dá)，已鑒定的16個(gè)ERD基因cDNA屬于不同的基因家族，作用于不同的代謝途徑，以增強(qiáng)擬南芥的抗旱性[2]，這些基因除了具備快速應(yīng)答干旱脅迫外，還具備應(yīng)答冷、高鹽、衰老、ABA (脫落酸)等多種逆境脅迫信號(hào)，表現(xiàn)出多樣化生化功能并存在于不同的亞細(xì)胞[3-5]，ERD1編碼葉綠體ATP依賴蛋白酶，防御葉綠體損傷；ERD13是植物特異性硫代谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，能與BAK1相互作用；ERD16是一種泛素化延伸蛋白[6-8]。擬南芥中ERD15基因受各種生物因子和非生物因子的誘導(dǎo)表達(dá)，是ABA反應(yīng)和依賴水楊酸(SA)防御途徑的重要調(diào)節(jié)器[9-10]。

基因組學(xué)研究證實(shí)，ERD15屬于一個(gè)高度保守的植物特有基因家族，ERD15蛋白具有典型的與PABP [poly(A) binding protein]作用的基序PAM2(PABP-interacting motif 2)，其他高度保守基序PAE1(PAM2 associated element 1)和QPR (amino acid sequence isoleucine-glutamine/histidine-glutamineproline-arginine)的功能還有待研究[11]。含有PAM2基序的蛋白稱為PACs (PAM2-containing proteins)家族蛋白，該家族蛋白參與mRNA代謝，同時(shí)也參與調(diào)控生物周期節(jié)律以及泛素化降解等[12-13]。這提示ERD15可能在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用。目前對(duì)于ERD15的研究主要是與脅迫響應(yīng)有關(guān)，大豆(Glycine max)在滲透脅迫下，ERD15蛋白結(jié)合并激活NRP-B啟動(dòng)子表達(dá)，調(diào)控引發(fā)細(xì)胞程序性死亡的相關(guān)基因[14]。低溫下葡萄(Vitis vinifera)的ERD15可以保護(hù)細(xì)胞膜，提高光合效率并促進(jìn)可溶性物質(zhì)的積累和抑制脂質(zhì)過氧化來增強(qiáng)植物抵抗外部應(yīng)激的能力[15]。Saeed等[16]報(bào)道桑樹(Morus alba)的ERD15蛋白能在酵母中驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮功能，其中第70~100位氨基酸是轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵區(qū)域，可能含有ERD15的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)擬南芥中的研究表明，ERD15可以瞬時(shí)被各種脅迫以及和脅迫相關(guān)的植物激素所誘導(dǎo)，如脫水、低溫、外界損傷、ABA、SA、高光和植物病原菌等[7,9-10,17]。在非生物脅迫響應(yīng)中,ERD15是ABA信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，過量表達(dá)ERD15會(huì)降低植物對(duì)ABA的敏感性，從而降低植株對(duì)干旱和寒冷的耐受性；相反，通過RNAi沉默導(dǎo)致ERD15表達(dá)缺失使得植株對(duì)ABA 超敏感, 從而提高耐旱性和抗冷性[9,18]。胡蘿卜(Daucus carota)ERD15基因過表達(dá)誘導(dǎo)水楊酸調(diào)控基因的應(yīng)答，增加了對(duì)軟腐歐文氏菌的抵抗力[9]。擬南芥中ERD15負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)途徑，阻止植物在生物脅迫時(shí)快速應(yīng)答，從而加劇對(duì)植物的損害; 但過表達(dá)ERD15可以提高葡萄和煙草(Nicotiana tabacum)的存活率,減少脂質(zhì)過氧化，提高滲透壓從而增強(qiáng)對(duì)干旱和冷脅迫的耐受性[15,19]。因此，不同植物中ERD15可能具有不同的功能[16,20-21]。

ERD15響應(yīng)各種逆境脅迫，是多種信號(hào)調(diào)節(jié)的樞紐，為深入探究ERD15基因的功能，本研究以擬南芥T-DNA插入純合突變體erd15為材料，進(jìn)行表型觀察分析，揭示了ERD15基因參與調(diào)控?cái)M南芥生殖生長過程，為進(jìn)一步研究該基因的功能和分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和培養(yǎng)條件

擬南芥(Arabidopsis thaliana)突變體erd15(SALK_202985)購自擬南芥生物資源中心ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center)，經(jīng)篩選鑒定后的純合突變體用于本試驗(yàn)。野生型(Col-0)由華南師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

擬南芥種子在黑暗中4℃春化3 d，用30% (V/V)次氯酸鈉消毒10 min，無菌水反復(fù)洗滌8~10次后播種在固體1/2MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度22℃，相對(duì)濕度60%~70%，16 h/8 h的光暗周期。幼苗長出2~4片真葉后，移栽到培養(yǎng)土中(營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1)，覆蓋保鮮膜保濕3 d后揭膜，相同溫度和光照條件繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 純合突變體DNA水平的鑒定

幼苗生長3周，剪取葉片采用CTAB法[22]提取基因組總DNA，以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR所用引物序列從http://signal.salk.edu/上獲取。采用基因特異引物L(fēng)P、RP和T-DNA通用引物L(fēng)B1.3 (表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出erd15純合突變體，并確定T-DNA的插入位點(diǎn)。反應(yīng)體系共20μL：模板1μL, 引物各1μL，2×TaqPCR Master Mix 10μL (上海生物工程有限公司)，加ddH2O至20μL，充分混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于凝膠成像系統(tǒng)成像。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3 純合突變體RNA水平的鑒定

取1周齡幼苗約100 mg為材料，采用Trizol法提取總RNA后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA進(jìn)行RT-PCR，分析基因表達(dá)水平。以Actin2(AT3G18780)為內(nèi)參基因，對(duì)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同DNA水平篩選實(shí)驗(yàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4 植株的表型觀測

隨機(jī)選取20株擬南芥野生型Col-0和突變體erd15植株，觀測并記錄蓮座葉數(shù)目、花序形態(tài)、果莢長度等性狀。使用體式熒光顯微鏡(徠卡,M205FA)和佳能相機(jī)(Canon EOS D70)拍攝記錄表型，使用Photoshop和Image J軟件對(duì)采集的圖像進(jìn)行處理和測量分析。統(tǒng)計(jì)4周齡生長狀況良好植株的蓮座葉數(shù)目；以種植日到第1朵花露白的天數(shù)為開花時(shí)間[23]；選擇發(fā)育到第14階段左右的花，用解剖針小心去除萼片和花瓣，觀察拍攝雌蕊表型;在植株花序下約10 cm處測量主莖直徑；花發(fā)育至第17階段時(shí)，取不同基因型角果各30個(gè)，測量果莢長度，并徒手橫切，觀察果莢內(nèi)部的種子腔[24-25]，按照Alvarez-Buylla等的方法劃分花發(fā)育階段[25]。收集成熟但未開裂的長角果，完全浸入脫色液中(乙醇∶乙酸體積比=3∶1)，脫色24 h使長角果透明,便于觀察種子表型和敗育情況。植株高度以主莖的最終長度為準(zhǔn)，生長50 d時(shí)進(jìn)行測量。在同一固體1/2MS培養(yǎng)基上，劃分區(qū)域均勻點(diǎn)播野生型和突變體種子，每區(qū)域播種50粒，共10個(gè)重復(fù)，6 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

選擇生長4周左右已成熟的蓮座葉，用CF Imager葉綠素?zé)晒饪焖俪上裣到y(tǒng)(Chlorophyll Fluorescence Imager System, Technologica公司, 英國)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定。Fv/Fm代表PSII潛在的最大光能轉(zhuǎn)化效率；Fv′/Fm′反映光合反應(yīng)中心PSII實(shí)際捕獲能量的傳遞效率；Fq′/Fm′為PSII實(shí)際的光化學(xué)量子效率，是反映植物光合能力的重要指標(biāo)之一；NPQ為非光化學(xué)淬滅系數(shù)，反映植物熱耗散能力[27-28]。測定前，將擬南芥幼苗暗處理30 min后測定初始熒光(Fo)，在6 164μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度下測定Fv/Fm，然后打開光照強(qiáng)度為100μmol/(m2·s)的測量光，光適應(yīng)5 min后測定Fv′/Fm′、Fq′/Fm′和NPQ等參數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析方法

使用軟件SPSS 23對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 純合突變體的鑒定

從圖1: A可見，ERD15(AT2G41430)由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，erd15(SALK_202985)突變體的T-DNA插入位點(diǎn)位于第一個(gè)外顯子上, 約627 bp處。

用ERD15基因的特異性引物L(fēng)P與RP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，野生型中擴(kuò)增出1條帶，條帶位置與目的基因(1 385 bp)大小一致，而與此對(duì)應(yīng)的erd15突變體中未擴(kuò)增出條帶，而用T-DNA特異性引物L(fēng)B1.3和RP進(jìn)行擴(kuò)增，erd15突變體中擴(kuò)增出1條特異條帶，條帶大小為500~750 bp，與引物的預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果一致，而野生型中未能擴(kuò)增出此條帶(圖1: B)。證明本試驗(yàn)所使用ERD15基因的T-DNA插入erd15突變體在DNA水平上是純合突變。為確定erd15突變體植株在轉(zhuǎn)錄水平是否仍存在ERD15基因的表達(dá)，從基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)erd15進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平鑒定，半定量PCR結(jié)果表明，以Actin2為內(nèi)參基因，野生型擬南芥擴(kuò)增出ERD15基因的CDS片段，而純合erd15突變體無表達(dá)產(chǎn)物(圖1: C)，這說明由于T-DNA的插入導(dǎo)致ERD15的轉(zhuǎn)錄表達(dá)缺失,erd15突變體為功能缺失突變體。

圖1 純合突變體的鑒定。A: ERD15基因結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位點(diǎn); B: erd15突變體基因水平檢測; C: erd15突變體轉(zhuǎn)錄水平的檢測。Fig. 1 Identification of homozygous mutant. A: ERD15 gene structure and T-DNA insertion site; B: Detection of erd15 mutant at gene level; C: Detection of erd15 gene at expression level.

2.2 erd15突變體的表型分析

將野生型擬南芥和erd15純合突變體共同種植進(jìn)行表型比較分析。從表2可見，erd15突變體的株高和野生型接近，無顯著差異(圖2: A)。植株?duì)I養(yǎng)生長后期，突變體的蓮座葉數(shù)目較野生型多37.97% (圖2: B)。生長28 d的擬南芥野生型和erd15突變體葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Fv′/Fm′、Fq′/Fm′和NPQ等均無顯著差異(表3)，這一定程度表明ERD15基因突變沒有改變erd15突變體的光合作用能力。erd15突變體開花時(shí)間較野生型植株提前3~4 d (圖2: C)，說明ERD15基因的缺失可能加速了植物由幼齡期向成熟期轉(zhuǎn)變。

在擬南芥生殖生長期，ERD15基因的缺失導(dǎo)致突變體植株花序表型異常(圖3: A~C)；角果表面出現(xiàn)皺褶，頂端膨大成楔形(圖3: D)，長度比野生型縮短37.67% (表2)，達(dá)顯著差異。主莖由細(xì)長的圓柱體變成扁平狀，比野生型的直徑增加75.97% (圖3: A, E，表3)。野生型Col-0自然開裂的長角果由2個(gè)心皮和1個(gè)隔膜組成，形成假兩室，種子通過株柄呈兩列附著在隔膜上；erd15突變體自然開裂的長角果由多心皮發(fā)育而成，內(nèi)部假隔膜部分不融合，有多排種子(圖3: F)。從角果的徒手橫切切片可見，野生型的角果內(nèi)有2個(gè)種子腔，erd15突變體長角果頂端膨大區(qū)域內(nèi)無明顯種子腔(圖3: G),并且比野生型的雌蕊異常膨大(圖3: H)，這進(jìn)一步說明erd15的雌蕊可能由多心皮融合而成。野生型長角果的平均種子數(shù)為46.94粒，erd15突變體為65.25粒(圖4: A, 表2)，增加了39.01%，可見erd15突變體長角果的平均長度較野生型短，但平均結(jié)籽數(shù)卻顯著增加。

表2 erd15突變體和野生型Col-0的表型Table 2 Phenotype of erd15 mutant and wild type Col-0

表3 erd15突變體和野生型Col-0的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 3 Chlorophyll fluorescent parameters of erd15 mutant and wild-type Col-0

圖2 野生型Col-0與erd15突變體的表型。A: 種子萌發(fā)60 d的植株; B: 蓮座葉; C: 長日照下erd15突變體開花。Fig. 2 Phenotype of wild-type Col-0 and erd15 mutant. A: Plant height at 60 days after germination; B: Rosette leaves; C: Early flowering of erd15 mutant under long-day.

擬南芥野生型和突變體種子均呈飽滿橢圓狀、無皺褶、棕色，沒有明顯差異(圖4: C)。野生型種子的萌發(fā)率為96.00%，erd15突變體為95.80% (圖4: B,表2)，無顯著差異。這表明ERD15基因的缺失雖然干擾了擬南芥的生殖生長，但并沒有導(dǎo)致育性下降。

圖4 野生型Col-0和erd15突變體的種子表型。A: 透明角果; B, C: 種子。Fig. 4 Seed phenotype of erd15 mutant and wild-type Col-0. A: Decolorized siliques; B, C: Seeds.

3 結(jié)論和討論

隨著基因組計(jì)劃的完成，反向遺傳學(xué)已經(jīng)是研究基因功能的有效方法之一。反向遺傳學(xué)是指從已知的基因序列出發(fā)，通過對(duì)靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、基因插入、基因置換等，從而獲得該基因突變產(chǎn)生的突變體，根據(jù)突變體表型的變化研究該基因的功能。目前擬南芥用農(nóng)桿菌侵染的方法創(chuàng)造出大量T-DNA插入突變體(http://signal.salk.edu/)。本文以擬南芥野生型Col-0和TDNA插入突變體erd15為材料，進(jìn)行了表型的初步分析，結(jié)果表明，erd15突變體植株在表型上與野生型發(fā)生了明顯變化且在后代可穩(wěn)定遺傳。本研究獲得的erd15突變體，erd15基因表達(dá)缺失，表明該突變體可以用于對(duì)ERD15基因功能的研究。

通過觀察，erd15突變體的蓮座葉數(shù)目增多, 出現(xiàn)早花現(xiàn)象，暗示著該基因的缺失表達(dá)使得植物過早地從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向了生殖生長[23]。Bravo等通過半定量PCR檢測不同組織中ERD15基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明ERD15在蓮座葉、莖、花和未成熟的長角果中均有表達(dá)[12]，這與該基因缺失后突變體與野生型出現(xiàn)差異表型的部位相一致，揭示ERD15基因?qū)τ跀M南芥植株正常的生長發(fā)育起重要作用。當(dāng)植物從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡時(shí)，莖頂分生組織會(huì)轉(zhuǎn)化成初生花序分生組織，后者直接產(chǎn)生花芽[29], 并且有研究表明，擬南芥dellaP突變體出現(xiàn)主莖增長，花原基數(shù)目增多與花序分生組織活性增加有關(guān)[23]。本研究中觀察到erd15突變體的主莖比野生型更寬，單個(gè)花序的花數(shù)比野生型更多，這與dellaP突變體的表型相似，推測ERD15基因的缺失可能會(huì)增強(qiáng)花序分生組織的活性。此外，erd15突變體角果縮短，出現(xiàn)褶皺且頂端膨大成楔形，心皮數(shù)增多，無明顯分隔的種子腔，且平均結(jié)籽數(shù)比野生型多，但野生型和erd15突變體葉片珠葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括PSII實(shí)際捕獲能量的傳遞效率Fv′/Fm′、PSII實(shí)際的光化學(xué)量子效率Fq′/Fm′和植物熱耗散能力指標(biāo)NPQ等沒有顯著差異，這表明ERD15基因的缺失加速了擬南芥開花，影響生長，但不是通過影響植株的光合作用來改變的。下一步可使用掃描電鏡觀察比較野生型和突變體花序分生組織活性和雌蕊發(fā)育過程，深入探究ERD15基因影響擬南芥生長發(fā)育的分子機(jī)制。