• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    兩株南海真菌Aspergillus aculeatus 1 P1和Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2的次級代謝產(chǎn)物研究

    2020-10-05 04:58:48韓清華謝興林田曉清樊成奇
    海洋漁業(yè) 2020年4期
    關鍵詞:波譜真菌產(chǎn)物

    韓清華,謝興林,田曉清,李 涵,樊成奇

    (1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室,上海 200090;2.中山大學藥學院,廣州 510006)

    海洋微生物主要包括生活在海水、海洋沉積物中的微生物及與海洋動植物共附生的微生物,是復雜動態(tài)的海洋生態(tài)系統(tǒng)中一個獨特、重要的組成部分,在海洋的物質循環(huán)、能量流動、生態(tài)平衡、環(huán)境凈化中承擔著重要的角色,對于維持海洋系統(tǒng)的功能、物種及群落多樣性的演化具有不可替代的作用。而在海洋生態(tài)系統(tǒng)漫長的演化過程中,海洋微生物形成了獨特和多樣的機制來適應高壓、黑暗、高鹽、低溫和寡營養(yǎng)等嚴酷的生存環(huán)境,從而進化出基因型、代謝途徑和生理生態(tài)功能的多樣性,成為地球上最豐富和最重要的戰(zhàn)略資源。據(jù)估計海洋微生物物種達2~10億種,具有陸生微生物所無法比擬的生態(tài)群落結構多樣性和物種多樣性[1]。因此,對海洋微生物資源的利用與開發(fā)已成為當今國內外研究的熱點領域[2]。海洋真菌次級代謝產(chǎn)物是海洋微生物代謝產(chǎn)物的主要來源,從2010年起,海洋真菌中發(fā)現(xiàn)的新的次級代謝產(chǎn)物占海洋微生物的比例超過50%,約占海洋天然產(chǎn)物的三分之一[3],其中活性化合物超過50%。表明海洋真菌是發(fā)現(xiàn)新化合物、開發(fā)海洋藥物的重要來源。

    南海海域遼闊,面積約350萬km2,平均水深約1 212 m,最深處5 559 m;其中,屬于我國的部分約210萬km2[4]。南海海洋生物資源種類繁多,有藻類(紅藻、褐藻、綠藻)、海綿動物、腔腸動物、軟體動物、棘皮動物、被囊動物、苔蘚蟲類、微生物等;南海海洋生物量大,前期從南海海洋生物中發(fā)現(xiàn)許多結構特異的次生代謝產(chǎn)物,如萜類、生物堿、糖類、脂類和甾體等,這些化合物不僅結構類型特殊,而且具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗心血管病、抗氧化、神經(jīng)生長與功能調節(jié)等活性,有望開發(fā)成新一代的海洋藥物。

    真菌作為南海海洋環(huán)境中一個重要的微生物類群,因其代謝產(chǎn)物結構和活性多樣、創(chuàng)新指數(shù)高、成藥性強、產(chǎn)量大等特點,近年來倍受研究者關注,已成為海洋天然產(chǎn)物研究的熱點[5],然而關于南海真菌活性次級代謝產(chǎn)物的相關研究起步較晚,且研究對象多集中在深海來源真菌、紅樹林內生菌、海綿、珊瑚及海星共附生真菌等[6-11],對南海近海的漁業(yè)捕撈區(qū)域中的真菌及其代謝產(chǎn)物的研究較少,因此對該區(qū)域的研究將為豐富南海真菌資源多樣性、發(fā)掘結構新穎的活性代謝產(chǎn)物提供基礎。本課題組前期從位于南海上川島沙堤漁港南32 km處表層海水中分離篩選到100多株真菌資源,并對其中部分菌株進行蛋白磷酸酶活性篩選,結果表明其中部分菌株具有較好的蛋白磷酸酶活性。本研究擬通過對兩株活性較好的潛在菌株Aspergillusaculeatus1 P1和Paraconiothyrium cyclothyrioides1 I2的次級代謝產(chǎn)物進行初步研究,分析其活性潛能,以期為南海真菌資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    生物材料:海水采自2018年6月12日南海上川島沙堤漁港南32 km處(水深0.5 m),站位112°42′E、21°19′N,冷藏保存運輸至實驗室。

    微生物鑒定材料:真菌DNA小劑量快速提取試劑盒(上海生工生物公司);18S引物(上海美吉生物公司);PCR擴增體系(康為世紀)。

    色譜填料和試劑:HP 20大孔吸附樹脂(Mitsubishi Chemical Ltd,Japan);凝膠Sephadex LH 20(Pharmacia Biotech,Sweden);預制GF254 TLC硅膠板(青島海洋化學公司);液相用乙腈、甲醇(色譜級,Tedia,USA);其余溶劑均為分析純(AR,上海國藥集團)。

    分離培養(yǎng)基:孟加拉紅固體培養(yǎng)基(葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,磷酸二氫鉀1.0 g,硫酸鎂0.5 g,瓊脂20.0 g,1/3000孟加拉紅溶液100 mL,陳海水1 000mL)[12];PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g,葡萄糖10.0 g,瓊脂18.0 g,陳海水1 000 mL);YPD固體培養(yǎng)基(酵母膏10.0 g,蛋白胨20.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂18.0 g,陳海水1 000 mL)。用于分離菌株時每種培養(yǎng)基添加氯霉素和萘啶酮酸各30 U·mL-1,pH 6.0~6.5[13]。發(fā)酵培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基。

    1.2 儀器

    高壓滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠,LDZX 75KBS型;電熱恒溫鼓風干燥箱:上海一恒科技有限公司,DHG 9123A型;微生物恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司,DHP 9162A型;高速微量離心機:上海生工生物有限公司,HICO 21型;PCR儀:杭州朗基科學儀器有限公司,AG 22331型;凝膠成像系統(tǒng):上海天能科技有限公司,GIS 1600型;酶標儀:TECAN,SPARK 10M型;半制備HPLC系統(tǒng):Shimadazu,LC 20AT pump,SIL 20A auto sampler,SPD M20A PDA detector;NMR:Bruker,AM 400 spectrometer(TMS內標);UPLC MS:Agilent,1290 HPLC 6224 TOFMS。

    1.3 共附生微生物的分離和培養(yǎng)

    1.3.1 菌株的分離

    將海水樣品過濾,濾紙剪碎后放至裝有10 mL無菌水的50 mL無菌離心管內,震蕩混勻后靜置于4℃冰箱過夜。將樣品懸液進行10-1、10-2、10-3的梯度稀釋,每個梯度分別取100μL涂布于孟加拉紅、PDA和YPD固體培養(yǎng)基上,將平板放于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)[14]。培養(yǎng)約1~2周后長出菌落,根據(jù)顏色、形態(tài)等特征挑取差異較大的菌落,接種至相應新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)分離培養(yǎng)。最終得到的菌株保存于YPD斜面培養(yǎng)基,編號并置于4℃冰箱備用。

    1.3.2 18S rDNA ITS序列分析

    將真菌液體發(fā)酵液減壓抽濾濃縮得菌絲體,取適量菌體于研缽中,加液氮充分研磨至粉末狀[15]。使用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒提取真菌基因組DNA,并于-20℃保存?zhèn)溆?。采?8S EF3:TCCTCTAAATGACCRAGTTTG和18S EF4:GGAAGGGRTGTATTTATTAG,擴增真菌18S rDNA ITS序列。

    PCR擴增體系為50μL:2×PCR MasterMix 25μL,引物各2μL,模板DNA 5μL,重蒸水16 μL。擴增程序:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min[16]。取5μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠,100 V電泳30 min,檢測DNA大小,然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。提取的基因組DNA于-20℃保存,統(tǒng)一送上海美吉生物科技有限公司測序。所測結果在NCBI網(wǎng)站比對并進行種屬歸類,結合相關文獻選擇編號為1 P1(Aspergillusaculeatus1 P1)和1 I2(Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2)的兩株真菌進行代謝產(chǎn)物研究。

    1.4 1 P1和1 I2菌株中化合物分離純化

    1.4.1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

    配制2瓶800 mL YPD液體培養(yǎng)基,置于2 L三角瓶中,121℃高溫滅菌30 min,再分別接入經(jīng)過活 化 培 養(yǎng) 的1 P1和1 I2菌 株,20°C、160 r·min-1進行搖床發(fā)酵培養(yǎng),5 d后得到種子發(fā)酵液。將1 P1菌株種子液按一定比例接種于含有0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中,在20℃、160 r·min-1分3批進行搖床發(fā)酵培養(yǎng),每批發(fā)酵培養(yǎng)10~15 d;將1 I2菌株種子液按一定比例接種于含有0.75 L馬丁氏液體培養(yǎng)基(KH2PO4:1g,MgSO4·7H2O:0.5 g,蛋白胨:5 g,葡萄糖:5 g)的2 L三角瓶中,在20℃、160 r·min-1分3批進行搖床發(fā)酵培養(yǎng),每批發(fā)酵培養(yǎng)10~15 d,兩株菌均得到約60 L發(fā)酵液。

    1.4.2 1 P1中化合物的提取分離

    菌株1 P1的發(fā)酵液經(jīng)抽濾得到菌絲體,菌絲體置于-80℃冰箱中冷凍,然后取出自然解凍破壁,依次加入2 L的丙酮和甲醇進行超聲破碎,分別提取3次,提取液減壓低溫濃縮除去有機溶劑,合并提取液并蒸干。濃縮后的浸膏加1.5 L純水溶解充分,然后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次,得到相應的石油醚(9.2 g)、乙酸乙酯(2.9 g)和正丁醇萃取物(22.6 g)。

    1 P1的乙酸乙酯部分經(jīng)Sephadex LH 20凝膠柱層析分離,氯仿∶甲醇為1∶1進行洗脫,得到Fr.1~Fr.5共5部分,將Fr.2經(jīng)HPLC反復進樣制備(流動相∶乙腈-0.1%三氟乙酸 水)得到化合物5(9.1 min)、6(13.2 min)、1(24.5 min);將Fr.4經(jīng)HPLC反復進樣制備(流動相:乙腈-0.1%三氟乙酸 水)得到化合物10(14.7 min)、11(27.7 min)、9(12.4 min);將Fr.3經(jīng)HPLC反復進樣制備(流動相:乙腈-0.1%三氟乙酸 水)得到化合物7(14.0 min)和8(29.8 min)。1 P1的石油醚部分經(jīng)正相硅膠柱進行分離,分別用氯仿∶甲醇為100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1的梯度洗脫,得到Fr.Ⅰ~Fr.Ⅴ共5部分,將Fr.Ⅲ經(jīng)HPLC反復進樣制備(流動相∶乙腈-0.1%三氟乙酸 水)得到化合物2(21.5 min);將Fr.Ⅴ經(jīng)Sephadex LH 20凝膠柱層析分離,氯仿∶甲醇為1∶1進行洗脫,得到化合物3和4。

    1.4.3 1 I2中化合物的提取分離

    菌株1 I2的發(fā)酵液經(jīng)抽濾得到菌絲體,菌絲體置于-80℃冰箱中冷凍,然后取出自然解凍破壁,依次加入2 L的丙酮和甲醇進行超聲破碎,分別提取3次,提取液減壓低溫濃縮除去有機溶劑,合并提取液并蒸干。濃縮后的浸膏加1.0 L純水溶解充分,然后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次,得到相應的石油醚(12.5 g)、乙酸乙酯(814 mg)和正丁醇萃取物(15.0 g)。

    將1 I2的石油醚部分經(jīng)正相硅膠柱進行分離,分別用氯仿∶甲醇為100∶1、60∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1的梯度洗脫,得到Fr.A~Fr.F共6部分,將Fr.C經(jīng)Sephadex LH 20凝膠柱層析分離,氯仿∶甲醇為1∶1進行洗脫,得到化合物12;將Fr.B經(jīng)正相硅膠柱進行分離,用石油醚:丙酮為30∶1洗脫,得到化合物14;將Fr.E經(jīng)HPLC反復進樣制備(流動相∶乙腈-0.1%三氟乙酸 水),得到化合物16(18.5 min)、17(19.4 min)和15(21.2 min);將Fr.F經(jīng)反相硅膠柱進行分離,甲醇 水進行洗脫,得到化合物13。

    2 結果與分析

    2.1 測序結果

    2株菌株送樣均測序拼接成功。將上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司所測結果在NCBI網(wǎng)站比對,種屬歸類如表1。

    2.2 真菌1 P1、1 I2化合物的結構鑒定

    2.2.1 1 P1中次級代謝產(chǎn)物的結構鑒定

    化合 物1:白 色 無 定 形 粉 末,1H NMR(CD3OD,600 MHz)數(shù)據(jù)如下:4.25(1H,d,J=7.8 Hz),4.11(1H,d,J=10.8 Hz),3.85(1H,dd,J=12.9,2.1 Hz),3.75(1H,s),3.62(1H,dd,J=9.0,7.8 Hz),3.53(1H,d,J=3.6 Hz),3.39(1H,d,J=10.8 Hz),2.17(1H,dd,J=6.9,3.6 Hz),1.21(3H,s),1.18(3H,s),1.00(6H,d,J=7.8 Hz),0.94(6H,d,J=10.8 Hz),13C NMR(CD3OD,125 MHz)數(shù)據(jù)如下:39.7(C 1),28.6(C 2),81.2(C 3),43.5(C 4),57.2(C 5),19.8(C 6),34.0(C 7),41.2(C 8),48.9(C 9),37.1(C 10),24.9(C 11),123.5(C 12),145.1(C 13),42.7(C 14),27.3(C 15),28.3(C 16),40.0(C 17),45.3(C 18),48.0(C 19),37.8(C 20),76.8(C 21),93.4(C 22),23.2(C 23),65.3(C 24),16.5(C 25),17.3(C 26),27.0(C 27),23.2(C 28),31.3(C 29),21.3(C 30),108.8(C 1′),73.9(C 2′),75.3(C 3′),70.2(C 4′),67.7(C 5′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定化合物為kudzusaponin SA4。

    化合 物2:白 色 無 定 形 粉 末,1H NMR(CDCl3,600 MHz)數(shù)據(jù)如下:5.25(1H,d,J=3.6 Hz),3.45(1H,d,J=4.5 Hz),1.11(3H,s),1.04(3H,s),0.94(3H,s),0.91(3H,s),0.90(3H,s),0.87(3H,s),13C NMR(CDCl3,125 MHz)數(shù)據(jù)如下:38.5(C 1),26.0(C 2),80.9(C 3),42.2(C 4),56.0(C 5),18.6(C 6),33.2(C 7),39.8(C 8),47.8(C 9),37.5(C 10),23.9(C 11),122.4(C 12),144.0(C 13),42.8(C 14),28.3(C 15),27.7(C 16),36.8(C 17),44.9(C 18),46.3(C 19),30.6(C 20),41.6(C 21),76.7(C 22),22.5(C 23),64.6(C 24),16.3(C 25),17.0(C 26),25.5(C 27),29.8(C 28),32.9(C 29),20.1(C 30),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定化合物為大豆皂醇。

    化合物3:白色無定形粉末,1H NMR(Pyr,600 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH5.74(1H,brs),5.26(1H,dd,J=15.3,7.5 Hz),5.19(1H,dd,J=15.0,8.4 Hz),4.83(1H,m),3.03(1H,t,J=12.3 Hz),2.56(1H,m),1.54(3H,s),1.07(3H,d,J=6.0 Hz),0.97(3H,d,J=7.2 Hz),0.88(3H,d,J=5.4 Hz),0.86(3H,d,J=6.0 Hz),0.67(3H,s),13C NMR(Pyr,125 MHz)數(shù)據(jù)如下:δC33.0(C 1),33.7(C 2),67.9(C 3),42.3(C 4),76.5(C 5),74.6(C 6),120.8(C 7),141.9(C 8),44.1(C 9),38.4(C 10),22.7(C 11),40.2(C 12),44.1(C 13),55.6(C 14),23.8(C 15),28.8(C 16),56.4(C 17),12.9(C 18),19.2(C 19),41.2(C 20),20.5(C 21),136.5(C 22),132.4(C 23),43.4(C 24),34.2(C 25),21.8(C 26),20.2(C 27),30.4(C 28),18.2(C 29),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為24 ethylcholesta 7,22 diene 3β,5α,6β triol。

    化合 物4:白 色 無 定 形 粉 末,1H NMR(CDCl3,600 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH5.57(1H,m),5.20(2H,m),3.64(1H,m),1.03(3H,d,J=6.6 Hz),0.94(3H,s),0.92(3H,d,J=6.6 Hz),0.84(3H,d,J=7.2 Hz),0.82(3H,d,J=6.6 Hz),13C NMR(CDCl3,125 MHz)數(shù)據(jù)如下:39.3(C 1),32.1(C 2),70.7(C 3),37.2(C 4),139.9(C 5),119.8(C 6),116.5(C 7),141.5(C 8),46.4(C 9),38.5(C 10),21.3(C 11),40.6(C 12),42.9(C 13),54.7(C 14),23.2(C 15),28.4(C 16),55.9(C 17),12.2(C 18),16.4(C 19),40.9(C 20),21.3(C 21),135.7(C 22),132.1(C 23),43.0(C 24),33.2(C 25),19.8(C 26),20.1(C 27),17.8(C 28),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為(22E,24R) ergosta 5,7,22 trien 3β ol。

    圖1 從南海真菌Aspergillus aculeatus 1 P1和Paraconiothyrium cyclothyrioides 1 I2中分離得到的化合物結構式Fig.1 Structural formulas of compounds isolated from two South China Sea fungi Aspergillus aculeatus 1 P1 and Paraconiothyrium cyclothyrioides 1 I2

    化合物5:淺褐色無定型粉末,1H NMR(CD3OD,400 MHz)信號:δH0.12(1H,m),0.72(3H,d,J=6.7 Hz),0.86(1H,m),1.21~1.38(1H,m),2.80(1H,m),3.18(1H,m),3.65(1H,m),4.21(1H,m),6.69(2H,d,J=7.8 Hz),6.97(2H,d,J=7.8 Hz)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的數(shù)據(jù)一致,鑒定為已知化合物4 羥基苯丙氨酸 亮氨酸。

    化合物6:淺黃色油狀物,HR ESI MS譜給出準分子離子峰m/z245.128 3([M+H]+,計算值為245.128 5),提示其分子式為C14H16N2O2。1H NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH7.27(5H,m),4.46(1H,s),4.09(1H,dd,J=11.2,2.8 Hz),3.56(1H,dd,J=18.8,8.0 Hz),3.39(1H,m),3.18(2H,m),2.10(1H,m),1.82(2H,m),1.24(1H,m)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道的數(shù)據(jù)基本一致,鑒定為已知化合物環(huán)(苯丙氨酸 脯氨酸)。

    化合物7:淺黃色粉末,HR ESI MS譜給出準分子離子峰m/z261.117 7([M+H]+,計算值為261.116 1),提示其分子式為C14H16N2O3。1H NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH7.04(1H,d,J=8.4 Hz),6.70(1H,d,J=8.8 Hz),4.36(1H,tlike),4.04(1H,dd,J=11.0,7.4 Hz),3.54(1H,m),3.36(1H,m),3.06(2H,m),2.19(1H,m),1.80(2H,m),1.21(1H,m)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[23]報道的數(shù)據(jù)基本一致,鑒定為已知化合物cyclo (L Pro L Tyr)。

    化合物8:淺黃色油狀物,1H NMR(CD3OD,600 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH7.55(1H,d,J=7.8 Hz),7.32(1H,d,J=7.8 Hz),7.06(3H,m),2.94(2H,t,J=7.2 Hz)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[24]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為已知芳香胺類化合物色胺,即吲哚乙胺。

    化合物9:黃色無定形粉末,HR ESI MS譜給出準分子離子峰m/z138.089 9([M+H]+,計算 值 為138.091 3),提 示 其 分 子 式 為C8H11NO。1H NMR(CD3OD,600 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH7.03(2H,d,J=8.4 Hz),6.70(2H,d,J=8.4 Hz),3.68(2H,t,J=7.2 Hz),2.71(2H,t,J=7.2 Hz)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻[25]報道的數(shù)據(jù)基本一致,鑒定為對羥基苯乙胺。

    化合物10:無色固體,HR ESI MS譜給出準分子離子峰m/z255.064 6([M+H]+,計算值為255.061 3),提示其分子式為C15H10O4。1H NMR(Pyr,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH8.47(1H,d,J=8.4 Hz),8.17(1H,s),7.86(1H,d,J=8.4 Hz),7.82(2H,d,J=8.4 Hz),7.29(2H,d,J=8.4 Hz),7.12(1H,d,J=2.4 Hz)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[26]報道的數(shù)據(jù)基本一致,鑒定為異黃酮類化合物7,4′ 二羥基異黃酮。

    化合物11:淺黃色固體,1H NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH8.13(1H,s),8.06(1H,d,J=8.8 Hz),7.37(2H,d,J=8.8 Hz),6.94(1H,dd,J=8.6,1.8 Hz),6.85(2H,d,J=8.8 Hz)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[27]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為異黃酮類化合物5,7,4 三羥基異黃酮。

    2.2.2 1 I2中次級代謝產(chǎn)物的結構鑒定

    化合物12:白色粉末,1H NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH6.50(1H,d,J=8.4 Hz),6.23(1H,d,J=8.4 Hz),5.21(1H,dd,J=15.2,7.6 Hz),5.14(1H,dd,J=15.2,8.0 Hz),3.96(1H,m),0.99(3H,d,J=6.4 Hz),0.90(3H,d,J=6.8 Hz),0.88(3H,s),0.83(3H,d,J=6.4 Hz),0.81(3H,s),13C NMR(CDCl3,100 MHz)數(shù)據(jù)如下:34.7(C 1),30.1(C 2),66.4(C 3),36.9(C 4),82.1(C 5),135.4(C 6),130.7(C 7),79.4(C 8),51.1(C 9),37.0(C 10),23.4(C 11),39.3(C 12),44.5(C 13),51.7(C 14),20.6(C 15),28.6(C 16),56.2(C 17),12.9(C 18),18.2(C 19),39.7(C 20),20.9(C 21),135.2(C 22),132.3(C 23),42.8(C 24),33.0(C 25),19.6(C 26),19.9(C 27),17.5(C 28),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[28]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為(22E) 5α,8α Epidioxyergosta 6,22 dien 3β ol。

    化合物13:淡黃色粉末,1H NMR(DMSO,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:7.87(1H,d,J=8.4 Hz),5.77(1H,d,J=5.2 Hz),5.63(1H,d,J=8.4 Hz),13C NMR(DMSO,100 MHz)數(shù)據(jù)如下:150.8(C 2),163.2(C 4),101.8(C 5),140.8(C 6),87.8(C 2′),73.6(C 3′),69.9(C 4′),84.9(C 5′),63.2(C 6′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[29]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為尿嘧啶核苷。

    化合物14:無色油狀物,1H NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH5.36(4H,m),3.66(3H,s),2.77(2H,t,J=6.2 Hz),2.32(2H,t,J=7.4 Hz),2.05(4H,m),1.59(2H,m),0.89(3H,t,J=6.4 Hz),13C NMR(CDCl3,100 MHz)數(shù)據(jù)如下:174.3(C 1),34.1(C 2),24.9(C 3),29.1(C 4),29.1(C 5),29.3(C 6),29.6(C 7),27.2(C 8),130.0(C 9),127.9(C 10),25.6(C 11),128.0(C 12),130.2(C 13),27.2(C 14),29.1(C 15),31.5(C 16),22.6(C 17),14.0(C 18),51.4(-OCH3),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[30]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為Methyl Linoleate。

    化合物15:無色油狀物,1H NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH5.34(4H,m),3.93(1H,m),3.69(1H,dd,J=11.4,3.9 Hz),3.60(1H,dd,J=11.4,5.8 Hz),2.77(2H,t,J=6.3 Hz),2.35(2H,t,J=7.6 Hz),2.04(4H,dd,J=14.0,7.0 Hz),2.04(4H,dd,J=13.4,6.6 Hz),1.63(2H,m,H 3′),0.89(3H,t,J=6.8 Hz),13C NMR(CDCl3,100 MHz)數(shù)據(jù)如下:174.3(C 1),34.1(C 2),24.9(C 3),29.1(C 4),29.1(C 5),29.3(C 6),29.6(C 7),27.2(C 8),130.0(C 9),127.9(C 10),25.6(C 11),128.1(C 12),130.2(C 13),27.2(C 14),29.1(C 15),31.5(C 16),22.6(C 17),14.1(C 18),65.2(C 1′),70.3(C 2′),63.3(C 3′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[31]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為1O(9Z,12Z octadecadienoyl)glycerol。

    化合物16:淡黃色油狀物,1H NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH5.65(1H,m),5.55(1H,m),5.48(1H,m),5.37(1H,m),4.09(1H,dd,J=12.8,6.2 Hz),2.34(2H,t,J=7.4 Hz),2.04(4H,m),1.64(2H,m),0.89(3H,t,J=6.8 Hz),13C NMR(CDCl3,100 MHz)數(shù)據(jù)如下:177.8(C 1),32.0(C 2),24.6(C 3),29.3(C 4),28.6(C 5),28.8(C 6),33.7(C 7),133.4(C 8),132.4(C 9),72.5(C 10),35.4(C 11),124.5(C 12),132.0(C 13),27.4(C 14),28.8(C 15),31.5(C 16),22.6(C 17),14.1(C 18),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[32]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為(8E,12Z) 10 Hydroxy 8,12 octadecadienoic acid。

    化合物17:無色油狀物,1H NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH5.36(4H,m),4.93(1H,m),3.83(4H,brd,J=4.4 Hz),2.77(2H,brt,J=6.2 Hz),2.37(1H,t,J=7.4 Hz),2.05(4H,dd,J=13.4,6.6 Hz,),1.64(2H,m),0.89(3H,t,J=6.6 Hz),13C NMR(CDCl3,100 MHz)數(shù)據(jù)如下:174.0(C 1),34.3(C 2),25.0(C 3),29.1(C 4),29.2(C 5),29.3(C 6),29.6(C 7),27.2(C 8),130.0(C 9),127.9(C 10),25.6(C 11),128.1(C 12),130.2(C 13),27.2(C 14),29.1(C 15),31.5(C 16),22.6(C 17),14.1(C 18),75.1(C 1′),62.6(C 2′),62.6(C 3′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[31]報道的數(shù)據(jù)一致,因此鑒定該化合物為2 linoleoylglycerol。

    3 討論與展望

    本文對位于南海上川島沙堤漁港南32 km處表層海水中獲得的2株真菌Aspergillus aculeatus1 P1和Paraconiothyrium cyclothyrioides1 I2的 化 學 成 分 進 行 了 研 究,從Aspergillus aculeatus1 P1中分離得到11個化合物,從Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2中分離得到6個化合物,化合物類型包括萜類、甾醇、環(huán)二肽、脂肪酸等,學者前期對棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的化學成分研究結果表明其中主要的化合物類型包括倍半萜類[33-34]、衣康酸衍生物和二酮哌嗪類[35];Paraconiothyrium屬作為2004年新發(fā)現(xiàn)的一個屬,近年來有多位學者對其進行化學成分及活性研究,對該屬的化學成分研究結果表明其中主要的化合物類型包括二萜烷類[36-37]、呋喃酮類[38]、異海松烷型二萜苷[39]、倍半萜類[40-43]、聚酮類[44]、縮酮類[45],活性研究結果表明部分二萜烷類、倍半萜類及縮酮類化合物具有細胞毒、抗菌及抗病毒活性,表明該屬微生物具有一定的代謝潛力,但是本研究從Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2中獲得的次級代謝產(chǎn)物種類較少,化合物結構類型與其他研究結果相比也較為簡單,猜測一方面可能是由于本研究所獲得的微生物樣本均來源于表層海水(0.5 m),而表層海水及沉積物環(huán)境相對較為簡單,與中底層海水及沉積物復雜環(huán)境相比,缺乏特殊的條件來刺激誘導真菌產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物及生物活性[46],另一方面,猜測可能是培養(yǎng)基較為單一、且培養(yǎng)條件較為簡單的緣故。雖然課題組在前期嘗試過利用5種不同培養(yǎng)基對Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2的代謝產(chǎn)物多樣性進行分析,并選擇了代謝產(chǎn)物多樣性最為豐富的馬丁氏培養(yǎng)基作為發(fā)酵條件,但是從研究結果來看,仍然未得到較為復雜的結構。

    近年來借助于飛速發(fā)展的基因組測序和生物信息數(shù)據(jù)挖掘技術發(fā)現(xiàn),微生物具有產(chǎn)生豐富次生代謝產(chǎn)物的遺傳基礎,其代謝潛能遠遠超過先前的認識,許多新的次生代謝產(chǎn)物編碼基因和基因簇陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。常規(guī)發(fā)酵條件優(yōu)化過程對于挖掘南海真菌中新結構代謝產(chǎn)物效率不高,沉默的生物合成基因簇限制了次生代謝產(chǎn)物的多樣性和新穎性。前期研究發(fā)現(xiàn)一株黃曲霉Aspergillusflavus中共含有編碼56個次級代謝產(chǎn)物的基因簇,但僅有少量編碼合成leporin類、黃曲霉毒素類、偶氮酸、哌嗪類等化合物的基因簇被發(fā)現(xiàn)[47]。在后基因組時代的今天,迫切需要研究利用各種沉默基因激活方法,提高南海真菌代謝產(chǎn)生各類活性天然產(chǎn)物的效率。

    蛋 白翻譯后修飾(post translational modification,PTM)是指對翻譯后的蛋白質進行共價加工的過程,通過一系列酶催化的在一個或多個氨基酸殘基加上或消除修飾基團的動態(tài)過程,改變蛋白質物化性質,進而影響蛋白質功效;其中最為頻繁的修飾包括磷酸化、乙?;?、甲基化和泛素化等[48]。其研究熱點在于利用蛋白質組學方法研究相關的重大疾病新靶點、新機制;在微生物代謝產(chǎn)物研究中,也有用于挖掘生物合成基因簇潛力、代謝產(chǎn)生新結構產(chǎn)物的嘗試。幾種修飾模式中研究較為透徹的是組蛋白的乙?;图谆饔谩=M蛋白修飾在真菌基因的表達中有廣泛的應用,組蛋白乙?;腿ゼ谆蛊浣Y構呈松散狀,有利于基因的轉錄,反之則使基因處于沉默狀態(tài)。研究效果顯著的例子是利用組蛋白去乙?;福╤istone deacetylase,HDAC)抑制劑增加真菌細胞內組蛋白的乙?;潭?,有利于DNA與組蛋白八聚體的解離使核小體結構趨于松弛,從而利于各種轉錄因子、協(xié)同轉錄因子與DNA結合位點的特異性結合,激活基因的轉錄,尤其是提高代謝相關基因的表達水平,成功改善了菌株代謝產(chǎn)物的多樣性或產(chǎn)量[49]。HENRIKSON等[50]在黑曲霉培養(yǎng)基中添加組蛋白去乙?;敢种苿┓⒅Z他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)后發(fā)現(xiàn)14個生物合成基因簇的表達量有大幅度提高,從而使黑曲霉代謝途徑發(fā)生改變,最終從發(fā)酵液中分離得到1個全新的代謝產(chǎn)物nygerone A,也是在黑曲霉中首次報道產(chǎn)生。前期本課題組利用SAHA對一株南極黃曲霉Aspergillussp.NJF3進行蛋白翻譯后磷酸化修飾調控的嘗試,結果表明其代謝產(chǎn)物多樣性、特定成分產(chǎn)量有明顯變化,后期將進一步優(yōu)化真菌的發(fā)酵條件,嘗試使用不同的海洋真菌培養(yǎng)基,嘗試適合的代謝調控方法,擴大發(fā)酵規(guī)模并富集微量成分,以期獲得較為復雜的結構新穎性化合物。

    本研究結果豐富了研究者對南海真菌多樣性及其代謝產(chǎn)物活性的了解,為藥源微生物發(fā)掘提供資源保障,同時也為研究人員通過活性追蹤方法、有目的地深入開展其代謝產(chǎn)物化學多樣性和活性研究提供指導。

    猜你喜歡
    波譜真菌產(chǎn)物
    低共熔溶劑在天然產(chǎn)物提取中的應用
    高等大型真菌與人類
    科學(2020年2期)2020-08-24 07:56:56
    《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》青年編委會
    真菌造房子
    琥珀酸美托洛爾的核磁共振波譜研究
    美國波譜通訊系統(tǒng)公司
    波譜法在覆銅板及印制電路板研究中的應用
    精神分裂癥磁共振波譜分析研究進展
    艾滋病合并侵襲性真菌感染的診治
    高效降解纖維素真菌的篩選與鑒定
    国产淫片久久久久久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| av国产免费在线观看| 男人舔奶头视频| 国产精品久久久久久精品电影| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 99九九线精品视频在线观看视频| 乱系列少妇在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 97超碰精品成人国产| 尾随美女入室| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久久久久成人| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲精品国产成人久久av| 乱人视频在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 免费观看在线日韩| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 三级国产精品片| 好男人在线观看高清免费视频| 男插女下体视频免费在线播放| 69人妻影院| 精品一区在线观看国产| 夫妻午夜视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女黄网站色视频| 精品人妻视频免费看| 色网站视频免费| 最近中文字幕2019免费版| h日本视频在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 国产不卡一卡二| 91久久精品电影网| 免费看a级黄色片| 精品国产三级普通话版| 亚洲av免费在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 两个人视频免费观看高清| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 能在线免费观看的黄片| 中文字幕免费在线视频6| 国产色爽女视频免费观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产男女超爽视频在线观看| 国产成人精品久久久久久| 男女啪啪激烈高潮av片| av天堂中文字幕网| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 天堂中文最新版在线下载 | 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜激情福利司机影院| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人美女网站在线观看视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| www.av在线官网国产| 国产精品一区二区性色av| 国产 一区精品| 在线免费观看的www视频| 综合色丁香网| 2021少妇久久久久久久久久久| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久久久久久丰满| 三级经典国产精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产v大片淫在线免费观看| 搞女人的毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 婷婷色av中文字幕| www.av在线官网国产| 男人舔女人下体高潮全视频| 大片免费播放器 马上看| 欧美高清性xxxxhd video| 久久鲁丝午夜福利片| 91av网一区二区| 一夜夜www| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| h日本视频在线播放| av免费观看日本| 国产真实伦视频高清在线观看| 免费观看精品视频网站| 国产伦在线观看视频一区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品一区二区性色av| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品日韩av在线免费观看| 视频中文字幕在线观看| 国产在视频线精品| 免费观看的影片在线观看| 久久精品夜色国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费观看精品视频网站| 免费无遮挡裸体视频| 国产熟女欧美一区二区| 国产成人精品婷婷| 麻豆成人午夜福利视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 91av网一区二区| 国产免费视频播放在线视频 | 亚洲自拍偷在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美成人午夜免费资源| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产男人的电影天堂91| 97精品久久久久久久久久精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品久久久久久av不卡| 丝袜喷水一区| 久久精品人妻少妇| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美xxⅹ黑人| 激情五月婷婷亚洲| 婷婷色av中文字幕| 人体艺术视频欧美日本| 有码 亚洲区| a级毛色黄片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 卡戴珊不雅视频在线播放| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产精品专区欧美| 街头女战士在线观看网站| 久久这里只有精品中国| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品一二三区在线看| 色5月婷婷丁香| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久99精品国语久久久| av卡一久久| 老女人水多毛片| 永久免费av网站大全| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一级av片app| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 18禁动态无遮挡网站| 亚洲色图av天堂| 日韩三级伦理在线观看| 日韩一区二区三区影片| 伦理电影大哥的女人| 国产 亚洲一区二区三区 | 大香蕉97超碰在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩精品有码人妻一区| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 深夜a级毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品国产三级专区第一集| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲av在线观看美女高潮| 成人毛片60女人毛片免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费看日本二区| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲18禁久久av| 久久精品国产亚洲网站| 波野结衣二区三区在线| 久久久久久国产a免费观看| 一级av片app| 国产av码专区亚洲av| 麻豆国产97在线/欧美| 麻豆av噜噜一区二区三区| 黄色日韩在线| 丰满乱子伦码专区| 国产在线一区二区三区精| 日本-黄色视频高清免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费观看在线日韩| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产高清三级在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产美女午夜福利| 白带黄色成豆腐渣| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 超碰av人人做人人爽久久| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美xxⅹ黑人| 欧美激情在线99| 国产成人精品一,二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美成人a在线观看| 日韩电影二区| 国产精品av视频在线免费观看| 好男人在线观看高清免费视频| 伦精品一区二区三区| 色吧在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 黄色日韩在线| 18禁在线播放成人免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲精品,欧美精品| 插阴视频在线观看视频| 免费看不卡的av| 久久久久精品久久久久真实原创| 最近的中文字幕免费完整| 色综合色国产| 日韩强制内射视频| 久久久a久久爽久久v久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久伊人网av| 人妻系列 视频| 国产黄片美女视频| 偷拍熟女少妇极品色| av在线老鸭窝| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 内射极品少妇av片p| 黑人高潮一二区| 婷婷色av中文字幕| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美性感艳星| 欧美97在线视频| 黄片wwwwww| 亚洲国产色片| 欧美区成人在线视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 深夜a级毛片| 国产不卡一卡二| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 最近中文字幕2019免费版| 99re6热这里在线精品视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一级毛片电影观看| 成人无遮挡网站| 精品久久久久久久久久久久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 两个人的视频大全免费| 久久久久久国产a免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 免费看日本二区| 看黄色毛片网站| 婷婷色麻豆天堂久久| 午夜日本视频在线| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 国国产精品蜜臀av免费| 99热这里只有是精品在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品色激情综合| 好男人视频免费观看在线| 禁无遮挡网站| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 好男人在线观看高清免费视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 青青草视频在线视频观看| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美3d第一页| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜福利高清视频| 91久久精品国产一区二区三区| 国产人妻一区二区三区在| 青春草视频在线免费观看| 午夜福利高清视频| 听说在线观看完整版免费高清| 久热久热在线精品观看| 特级一级黄色大片| 又大又黄又爽视频免费| 丰满少妇做爰视频| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩欧美 国产精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久精品久久久久久久性| 黄色一级大片看看| 亚洲av男天堂| 成人性生交大片免费视频hd| 人人妻人人看人人澡| 成年女人看的毛片在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲精品视频女| 美女cb高潮喷水在线观看| av在线亚洲专区| 免费观看a级毛片全部| 日韩精品青青久久久久久| 看免费成人av毛片| 亚洲av国产av综合av卡| 丰满乱子伦码专区| 日本三级黄在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久这里只有精品中国| 欧美性感艳星| 精品欧美国产一区二区三| 内地一区二区视频在线| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 大香蕉97超碰在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 18禁在线播放成人免费| 国产在线一区二区三区精| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲最大成人av| 久久久久久久国产电影| h日本视频在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产三级在线视频| 久久精品久久久久久久性| 日韩人妻高清精品专区| 成年人午夜在线观看视频 | 日本免费a在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| av免费在线看不卡| 国产乱人偷精品视频| 免费观看a级毛片全部| a级毛色黄片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 看十八女毛片水多多多| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最新中文字幕久久久久| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一级av片app| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品国产亚洲网站| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 天天躁日日操中文字幕| 国产毛片a区久久久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美潮喷喷水| 精品久久久久久久久av| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产欧美在线一区| 国产淫语在线视频| 一边亲一边摸免费视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产久久久一区二区三区| 日本色播在线视频| 如何舔出高潮| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲成人一二三区av| 国产av在哪里看| 久久精品夜色国产| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产高潮美女av| 亚洲四区av| 国产av码专区亚洲av| 六月丁香七月| 国产有黄有色有爽视频| 午夜免费激情av| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产在视频线精品| 亚洲电影在线观看av| 婷婷色综合www| 成人亚洲欧美一区二区av| 午夜福利视频精品| 免费av不卡在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲最大成人av| 97超碰精品成人国产| 久久久久久久午夜电影| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产欧美在线一区| a级一级毛片免费在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 国产激情偷乱视频一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 日韩欧美 国产精品| 简卡轻食公司| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产视频内射| 少妇人妻一区二区三区视频| 18禁动态无遮挡网站| av国产免费在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| eeuss影院久久| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 又爽又黄无遮挡网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲成人一二三区av| 美女主播在线视频| 精品久久久久久成人av| 日本与韩国留学比较| 高清欧美精品videossex| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av成人av| 亚洲久久久久久中文字幕| 中文资源天堂在线| av在线观看视频网站免费| 日本av手机在线免费观看| 日本黄色片子视频| 日本免费在线观看一区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在现免费观看毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线 av 中文字幕| 精品酒店卫生间| 日本色播在线视频| 午夜爱爱视频在线播放| 大香蕉久久网| 亚洲综合色惰| 亚洲欧美一区二区三区国产| kizo精华| 国产黄频视频在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品一二三| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲av免费在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产熟女欧美一区二区| 大香蕉97超碰在线| 九草在线视频观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 在线 av 中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩视频在线欧美| 99久久精品热视频| 久久久久网色| 亚洲精品aⅴ在线观看| 天堂√8在线中文| 久热久热在线精品观看| 日日啪夜夜撸| 毛片女人毛片| 日韩国内少妇激情av| 精品久久国产蜜桃| 日本黄色片子视频| 国产精品久久久久久久电影| 2018国产大陆天天弄谢| 精品一区二区三卡| 国产成人91sexporn| 女人被狂操c到高潮| 国产精品综合久久久久久久免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 极品教师在线视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲性久久影院| 美女主播在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品色激情综合| 高清欧美精品videossex| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中文字幕久久专区| 精品人妻熟女av久视频| av黄色大香蕉| 久久鲁丝午夜福利片| 少妇人妻一区二区三区视频| 观看美女的网站| 免费看日本二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产成人91sexporn| 日韩亚洲欧美综合| 国产在视频线精品| 免费大片18禁| 如何舔出高潮| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品久久久久久久性| 久久99精品国语久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人精品久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲高清免费不卡视频| 黄色日韩在线| 99九九线精品视频在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 日韩强制内射视频| 看黄色毛片网站| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品自拍成人| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩欧美精品v在线| 99热这里只有是精品在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲人与动物交配视频| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品精品国产色婷婷| 人人妻人人看人人澡| 国产视频首页在线观看| 免费看不卡的av| 日韩强制内射视频| 中文资源天堂在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本色播在线视频| 成年免费大片在线观看| 男女边摸边吃奶| 精品一区二区三区视频在线| 大话2 男鬼变身卡| 午夜老司机福利剧场| 国产一区二区三区综合在线观看 | 美女高潮的动态| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99久国产av精品| 欧美bdsm另类| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费av毛片视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一级毛片 在线播放| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久午夜电影| 午夜免费男女啪啪视频观看| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲在久久综合| 天天躁日日操中文字幕| 日本免费在线观看一区| 能在线免费观看的黄片| 久久99蜜桃精品久久| 午夜福利成人在线免费观看| 热99在线观看视频| 国产久久久一区二区三区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美潮喷喷水| 中国国产av一级| h日本视频在线播放| 老司机影院成人| 国产黄色免费在线视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本wwww免费看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 亚洲av免费高清在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 久久99蜜桃精品久久| 午夜福利成人在线免费观看| 日日撸夜夜添| 欧美97在线视频| av一本久久久久| 日韩成人伦理影院| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 色综合色国产| 国产亚洲精品久久久com| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲av在线观看美女高潮| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产激情偷乱视频一区二区| 观看美女的网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 中文字幕制服av| 免费电影在线观看免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 舔av片在线| 最近中文字幕2019免费版| 99热6这里只有精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 男女那种视频在线观看| 夫妻午夜视频| 人体艺术视频欧美日本| 成年免费大片在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 在线a可以看的网站| 久久99热6这里只有精品| 一级片'在线观看视频| 久久久久国产网址| 99热全是精品| 美女国产视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲欧美成人精品一区二区| 老司机影院成人| 色综合亚洲欧美另类图片| 不卡视频在线观看欧美| 免费黄色在线免费观看| 777米奇影视久久|