HPLC-UV 法測(cè)定蝙蝠蛾擬青霉菌粉中腺苷的含量

趙雁冰 張艷華 楊恒 顧婭楠 張麗娟

(天津市康婷生物工程集團(tuán)有限公司，天津 300385)

0 引言

腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷[1]，具有改善心腦血液循環(huán)、抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放等活性[2]。在新冠肺炎時(shí)期，腺苷可作為先天免疫的介質(zhì)在炎癥和損傷的肺組織中高度分泌，通過(guò)腺苷受體A1、A2A、A2B、A3 的激活，在急性肺損傷的病理過(guò)程中起到抗炎、抑制免疫風(fēng)暴產(chǎn)生、保護(hù)臟器損傷、修復(fù)重塑組織的作用[3]。因此，對(duì)蝙蝠娥擬青霉菌粉中腺苷的研究具有重要意義。

目前腺苷含量測(cè)定的檢測(cè)手段層出不窮。本文采用了HPLC-UV 法測(cè)定腺苷含量，其檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、試劑毒性小、耗材少，檢測(cè)成本較低。為腺苷含量的研究提供了檢測(cè)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Waters Arc 液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器；

電子天平(精度0.1mg 和精度0.01mg)；

超聲波清洗儀。

1.2 試劑與材料

甲醇(色譜純)；

乙腈(色譜純)；

腺苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

針式有機(jī)過(guò)濾膜，0.22μm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0mg·mL-1)精密稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確至0.01mg)置于10mL 棕色容量瓶中，用5%甲醇溶液定容至刻度，于4℃冰箱中保存。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，粒徑5.0μm)；

柱溫：25℃；

流動(dòng)相：乙腈∶水=5∶95；

流速：0.6mL·min-1；

檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；

進(jìn)樣量：10μL。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：取適量1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL 的容量瓶中，用5%甲醇溶液定容至刻度，配制成濃度與樣品中腺苷濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

樣品處理：精密稱取0.5g 待測(cè)試樣于50mL 離心管中，精確加入10mL 5%甲醇溶液，常溫下，超聲提取20 min，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

分別取標(biāo)準(zhǔn)使用液和樣品提取液10μL，注入高效液相色譜儀，按照1.4 色譜條件檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取液的比較

本實(shí)驗(yàn)比較了90%甲醇溶液和5%甲醇溶液兩種提取液，90%甲醇溶液作為提取液時(shí)，譜圖上有很大的前沿峰，考慮溶劑效應(yīng)影響。因此選用了5%甲醇溶液作為提取液，譜圖中峰型較好，而且，選用5%甲醇溶液所用有機(jī)試劑較少，對(duì)人體傷害較小，成本較低。因此，最后選用5%甲醇溶液作為該方法的提取溶液。

2.2 超聲提取時(shí)間的對(duì)比

稱取約0.5g 試樣5 份，超聲提取時(shí)間分別是：10min、20min、30min、40min、50min，5 個(gè)提取時(shí)間測(cè)得的樣品含量接近，為了充分提取，最后選擇20min 為最佳的提取時(shí)間。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.4.1 的色譜條件經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器測(cè)試，3D 光譜圖顯示260nm 波長(zhǎng)處腺苷有最大吸收。因此，260nm 作為該檢測(cè)方法的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系、檢出限和定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：臨用前吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用5%甲醇溶液稀釋成濃度分別為：5.08μg·mL-1、10.16μg·mL-1、20.32μg·mL-1、40.64μg·mL-1、60.96μg·mL-1、101.6μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別取以上各濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液注入色譜儀，在1.4 色譜條件下測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程為y=55,124.01386x+7,648.57508，相關(guān)系數(shù)為0.999991，在濃度為5.08～101.6μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

當(dāng)稱樣量為0.5g,定容體積為10mL 時(shí)，以信噪比S/N=3 的濃度為檢出限，檢出限為0.17mg·kg-1，以3 倍的檢出限對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，定量限為0.51mg·kg-1。

2.5 精密度和回收率

精密稱取6 份待測(cè)樣品測(cè)定精密度為0.8%，按試樣中腺苷含量的80%、100%、120%為3 個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平測(cè)試3個(gè)平行樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。計(jì)算結(jié)果符合回收率驗(yàn)證的技術(shù)要求，結(jié)果見表1。

表1 蝙蝠蛾擬青霉菌粉中腺苷的加標(biāo)回收率

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

5 批蝙蝠蛾擬青霉菌粉樣品，每批次分別稱取兩份樣品，按照1.5.2 的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前期處理，按照1.4 的色譜條件測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到技術(shù)指標(biāo)要求。

3 結(jié)語(yǔ)

樣品經(jīng)5%甲醇溶液超聲提取，過(guò)0.22μm 的有機(jī)濾膜、經(jīng)C18色譜柱分離，最后用HPLC-UV 檢測(cè)器檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、回收率高。為含腺苷產(chǎn)品的方法研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了參考方法。