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    HPLC-UV 法測(cè)定蝙蝠蛾擬青霉菌粉中腺苷的含量

    2020-10-03 11:26:22趙雁冰張艷華楊恒顧婭楠張麗娟
    化工管理 2020年16期
    關(guān)鍵詞:甲醇溶液腺苷提取液

    趙雁冰 張艷華 楊恒 顧婭楠 張麗娟

    (天津市康婷生物工程集團(tuán)有限公司,天津 300385)

    0 引言

    腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷[1],具有改善心腦血液循環(huán)、抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放等活性[2]。在新冠肺炎時(shí)期,腺苷可作為先天免疫的介質(zhì)在炎癥和損傷的肺組織中高度分泌,通過(guò)腺苷受體A1、A2A、A2B、A3 的激活,在急性肺損傷的病理過(guò)程中起到抗炎、抑制免疫風(fēng)暴產(chǎn)生、保護(hù)臟器損傷、修復(fù)重塑組織的作用[3]。因此,對(duì)蝙蝠娥擬青霉菌粉中腺苷的研究具有重要意義。

    目前腺苷含量測(cè)定的檢測(cè)手段層出不窮。本文采用了HPLC-UV 法測(cè)定腺苷含量,其檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、試劑毒性小、耗材少,檢測(cè)成本較低。為腺苷含量的研究提供了檢測(cè)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與設(shè)備

    Waters Arc 液相色譜儀,配有紫外檢測(cè)器;

    電子天平(精度0.1mg 和精度0.01mg);

    超聲波清洗儀。

    1.2 試劑與材料

    甲醇(色譜純);

    乙腈(色譜純);

    腺苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);

    針式有機(jī)過(guò)濾膜,0.22μm。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0mg·mL-1)精密稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確至0.01mg)置于10mL 棕色容量瓶中,用5%甲醇溶液定容至刻度,于4℃冰箱中保存。

    1.4 色譜條件

    色譜柱:C18柱(250mm×4.6mm,粒徑5.0μm);

    柱溫:25℃;

    流動(dòng)相:乙腈∶水=5∶95;

    流速:0.6mL·min-1;

    檢測(cè)波長(zhǎng):260nm;

    進(jìn)樣量:10μL。

    1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

    標(biāo)準(zhǔn)使用液配制:取適量1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL 的容量瓶中,用5%甲醇溶液定容至刻度,配制成濃度與樣品中腺苷濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

    樣品處理:精密稱取0.5g 待測(cè)試樣于50mL 離心管中,精確加入10mL 5%甲醇溶液,常溫下,超聲提取20 min,過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。

    分別取標(biāo)準(zhǔn)使用液和樣品提取液10μL,注入高效液相色譜儀,按照1.4 色譜條件檢測(cè)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同提取液的比較

    本實(shí)驗(yàn)比較了90%甲醇溶液和5%甲醇溶液兩種提取液,90%甲醇溶液作為提取液時(shí),譜圖上有很大的前沿峰,考慮溶劑效應(yīng)影響。因此選用了5%甲醇溶液作為提取液,譜圖中峰型較好,而且,選用5%甲醇溶液所用有機(jī)試劑較少,對(duì)人體傷害較小,成本較低。因此,最后選用5%甲醇溶液作為該方法的提取溶液。

    2.2 超聲提取時(shí)間的對(duì)比

    稱取約0.5g 試樣5 份,超聲提取時(shí)間分別是:10min、20min、30min、40min、50min,5 個(gè)提取時(shí)間測(cè)得的樣品含量接近,為了充分提取,最后選擇20min 為最佳的提取時(shí)間。

    2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

    將腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.4.1 的色譜條件經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器測(cè)試,3D 光譜圖顯示260nm 波長(zhǎng)處腺苷有最大吸收。因此,260nm 作為該檢測(cè)方法的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

    2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系、檢出限和定量限

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:臨用前吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用5%甲醇溶液稀釋成濃度分別為:5.08μg·mL-1、10.16μg·mL-1、20.32μg·mL-1、40.64μg·mL-1、60.96μg·mL-1、101.6μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別取以上各濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液注入色譜儀,在1.4 色譜條件下測(cè)定,以濃度為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程為y=55,124.01386x+7,648.57508,相關(guān)系數(shù)為0.999991,在濃度為5.08~101.6μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    當(dāng)稱樣量為0.5g,定容體積為10mL 時(shí),以信噪比S/N=3 的濃度為檢出限,檢出限為0.17mg·kg-1,以3 倍的檢出限對(duì)應(yīng)的濃度為定量限,定量限為0.51mg·kg-1。

    2.5 精密度和回收率

    精密稱取6 份待測(cè)樣品測(cè)定精密度為0.8%,按試樣中腺苷含量的80%、100%、120%為3 個(gè)添加水平,每個(gè)添加水平測(cè)試3個(gè)平行樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。計(jì)算結(jié)果符合回收率驗(yàn)證的技術(shù)要求,結(jié)果見表1。

    表1 蝙蝠蛾擬青霉菌粉中腺苷的加標(biāo)回收率

    2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

    5 批蝙蝠蛾擬青霉菌粉樣品,每批次分別稱取兩份樣品,按照1.5.2 的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前期處理,按照1.4 的色譜條件測(cè)定峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算含量,檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到技術(shù)指標(biāo)要求。

    3 結(jié)語(yǔ)

    樣品經(jīng)5%甲醇溶液超聲提取,過(guò)0.22μm 的有機(jī)濾膜、經(jīng)C18色譜柱分離,最后用HPLC-UV 檢測(cè)器檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、回收率高。為含腺苷產(chǎn)品的方法研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了參考方法。

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