高壓均質(zhì)對(duì)乳清蛋白糖基化產(chǎn)物抗氧化的影響

于鵬

乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院（上海 200436）

乳清蛋白因其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及良好的消化吸收特性，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。研究表明乳清蛋白的功能特性受到加工處理?xiàng)l件的影響而發(fā)生顯著變化。熱處理是乳品加工過程中最基本和普遍的操作單元。在加熱過程中，牛乳中的蛋白質(zhì)與乳糖或者其他碳水化合物會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而改變其營(yíng)養(yǎng)、消化性等功能特性[2]。近些年，針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)與各種碳水化合物的反應(yīng)機(jī)制及糖基化對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的改變的研究逐漸涌現(xiàn)[3-4]。

巖藻多糖是一種富含硫酸基的大分子多糖，廣泛存在于褐色海藻中。隨著研究的深入，巖藻多糖日益凸顯的生物活性功能，特別是在抗氧化[5]、抑制腫瘤[6]及提高免疫力[7]等方面逐漸受到關(guān)注。然而巖藻多糖生物活性功能受到分子結(jié)構(gòu)、硫酸基團(tuán)含量及分子量大小等多種因素的影響[8]。高壓均質(zhì)，特別是超高壓均質(zhì)作為一種新興的加工處理方式，正逐漸成功應(yīng)用到食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[9-10]。在加工處理過程中，由高壓均質(zhì)帶來的強(qiáng)烈的剪切力和湍流會(huì)對(duì)被處理物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或功能特性產(chǎn)生一定的影響[11]。Doost等[12]研究發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白與和半乳糖經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后，在55 ℃，相對(duì)濕度65%下反應(yīng)6 h后，蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。Li等[13]通過研究表明隨著均質(zhì)壓力的增加，巖藻多糖分子量隨之下降，同時(shí)其體外抗氧化能力呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

雖然關(guān)于糖基化的研究較多，但是乳清蛋白和巖藻多糖的相關(guān)研究仍較少。高壓均質(zhì)對(duì)乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的抗氧化性能的研究鮮見報(bào)道。試驗(yàn)通過對(duì)乳清蛋白-巖藻多糖混合物進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，研究不同均質(zhì)壓力對(duì)2種混合物后期糖基化產(chǎn)物的抗氧化特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

90%乳清分離蛋白BiPRO?（美國(guó)安格普有限公司）；巖藻多糖（北京雷力聯(lián)合海洋生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京仁成工業(yè)株式會(huì)社（TCI））；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Five Easy pH計(jì)（梅特勒-多利多國(guó)際有限公司）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱HPP110（德國(guó)美墨爾特（Memmert）有限公司）；FA2014分析天平（上海天平儀器廠）；紫外分光光度計(jì)SP-752（上海光譜儀器有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)Free Zone（LABCONCO）。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的制備

乳清蛋白和巖藻多糖按照質(zhì)量比1∶3溶于蒸餾水中，用乳酸調(diào)節(jié)至pH 6，充分混勻后分別經(jīng)過0，70和120 MPa壓力均質(zhì)，均質(zhì)后的溶液置于-80 ℃冰箱中凍存一晚，置于凍干機(jī)中凍干至少48 h。稱取2 g左右的凍干粉均勻平鋪于培養(yǎng)皿中，置于相對(duì)濕度79%、溫度55 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應(yīng)一定時(shí)間制得乳清蛋白-巖藻多糖共聚物（WPI-FD）。

1.3.2 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物褐變程度的測(cè)定

根據(jù)前期試驗(yàn)方案和Corzo-Martínez等[14]研究方法，精確稱取0.1 g糖基化反應(yīng)共聚物WPI-FD，用去離子水溶解后定容至100 mL，分別在294和420 nm下測(cè)定其吸光度。樣品的吸光度若超過1.5，可對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以保證吸光度在分光光度計(jì)檢測(cè)最佳范圍內(nèi)，每個(gè)樣品檢測(cè)3次。

1.3.3 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考前期試驗(yàn)方法。稱取0.1 g WPI-FD，然后用去離子水混合均勻后定容至25 mL容量瓶中配制成4 mg/mL溶液。取2 mL混合液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH混勻后放置于37 ℃暗室培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

式中：Ai為樣品和0.1 mmol/L DPPH（1∶1，V/V）混合液吸光度；At為樣品和無水乙醇（1∶1，V/V）混合液吸光度；A0為無水乙醇和0.1 mmol/L DPPH（1∶1，V/V）混合液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同均質(zhì)壓力條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物褐變程度

從圖1可以看出，糖基化反應(yīng)能夠顯著改變?nèi)榍宓鞍缀蛶r藻多糖混合物的外觀特征，隨著糖基化反應(yīng)進(jìn)行，樣品的顏色逐漸由淺變深。為了更好評(píng)價(jià)糖基化反應(yīng)的褐變程度，進(jìn)而了解反應(yīng)體系的糖基化進(jìn)程，試驗(yàn)過程中分別在290和420 nm條件下對(duì)糖基化產(chǎn)物的吸光度進(jìn)行了測(cè)定，相關(guān)結(jié)果見表1。

由圖1和表1可知，均質(zhì)壓力增加，可以改變?nèi)榍宓鞍?巖藻多糖混合物的外觀顏色。在0 h時(shí)，乳清蛋白-巖藻多糖混合物在294和420 nm的吸光度隨著均質(zhì)壓力增加而逐漸增大，說明乳清蛋白-巖藻多糖混合物在均質(zhì)過程中會(huì)受到一定程度的熱負(fù)荷影響，從而促使蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生反應(yīng)[15]。從圖1可以看出乳清蛋白-巖藻多糖樣品經(jīng)過120 MPa處理后（C）顏色較未經(jīng)過或者低壓處理的組（A和B）更深，類似結(jié)果在Grácia-Juliá等[16]研究中得到體現(xiàn)。Huang等[17]通過高分辨質(zhì)譜研究表明高壓均質(zhì)能顯著增加糖基化反應(yīng)位點(diǎn)，100 MPa預(yù)處理對(duì)牛血清白蛋白糖基化反應(yīng)的影響最為顯著。這與試驗(yàn)結(jié)果較為相似，從表1可以看出，乳清蛋白-巖藻多糖樣品經(jīng)過高壓均質(zhì)后可以加速糖基化進(jìn)程，相同條件下經(jīng)過70 MPa及以上壓力均質(zhì)后，樣品在80 h以后的吸光度無顯著變化（A420nm）。

圖1 不同條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物

表1 不同均質(zhì)壓力條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化反應(yīng)褐變程度

2.2 不同均質(zhì)壓力條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于體外抗氧化研究中，試驗(yàn)通過對(duì)不同均質(zhì)壓力條件處理下的乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可知，隨著均質(zhì)壓力增加，乳清蛋白-巖藻多糖混合物自由基清除率從58.89%顯著增加到65.98%（p＜0.05），120 MPa處理后的樣品自由基清除率比未處理組高12%左右，且隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，糖基化產(chǎn)物的抗氧化性能逐漸增加。0 MPa處理?xiàng)l件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的DPPH清除率在80 h達(dá)到最大，隨后有輕微下降，但是變化并不顯著（p＞0.05）。由表2可見，動(dòng)態(tài)超高壓均質(zhì)處理后的樣品在反應(yīng)60 h后，其糖基化產(chǎn)物自由基清除率基本趨于穩(wěn)定，無顯著變化。這與未經(jīng)均質(zhì)處理的樣品相比，反應(yīng)時(shí)間明顯提前。雖然乳清蛋白和巖藻多糖混合物經(jīng)過120 MPa均質(zhì)處理后，其糖基化產(chǎn)物在90 h時(shí)DPPH清除率達(dá)到最大，但是其與0 MPa（80 h）和70 MPa（80 h）下的糖基化產(chǎn)物的自由基清除率無明顯差異。這說明高壓均質(zhì)可以增加乳清蛋白-巖藻多糖混合物的抗氧化能力，但是隨著糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，最終反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最終基本趨于一致。

均質(zhì)壓力/MPa DPPH自由基清除率/%0 h 60 h 80 h 90 h 0 58.89±2.76a 67.72±2.39cd 72.23±0.97ef 69.78±2.14cde 70 62.38±2.53ab 70.89±4.88de 74.49±3.33ef 73.57±2.58ef 120 65.98±2.68bc 73.53±1.16ef 76.09±1.57f 77.49±0.78f注: 字母不同, 表示差異顯著 (p＜0.05)

3 結(jié)論

對(duì)不同均質(zhì)條件下的乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的反應(yīng)特性和DPPH自由基清除率進(jìn)行試驗(yàn)。糖基化產(chǎn)物反應(yīng)特性試驗(yàn)結(jié)果表明，高壓均質(zhì)能夠顯著改變?nèi)榍宓鞍缀蛶r藻多糖混合物的外觀色澤。隨著均質(zhì)壓力增加，混合物的顏色逐漸由淺變深。同時(shí)高壓均質(zhì)能夠瞬時(shí)促進(jìn)蛋白質(zhì)和多糖之間發(fā)生反應(yīng)，從而加速糖基化反應(yīng)進(jìn)程。此外，高壓均質(zhì)還可以提高糖基化反應(yīng)產(chǎn)物體外抗氧化活性，均質(zhì)組與非均質(zhì)組相比，高壓均質(zhì)可以縮短糖基化反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能達(dá)到最佳反應(yīng)時(shí)間，但是高壓均質(zhì)對(duì)乳清蛋白和巖藻多糖混合物最終的糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率大小的提升無顯著作用。