雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留風(fēng)險(xiǎn)篩查

梁飛燕，辛麗娜*，林小瑩

廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（南寧 530021）

硝基咪唑類藥物是一類具有5-硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，其作用機(jī)制主要是破壞細(xì)菌細(xì)胞胞漿中的硝基還原酶，從而干擾細(xì)菌DNA代謝過(guò)程，引起細(xì)菌DNA螺旋鏈的損傷、斷裂、解旋，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。硝基咪唑類主要用于抗滴蟲(chóng)、抗阿米巴原蟲(chóng)和抗厭氧菌感染，對(duì)禽類弧菌性肝炎、禽類毛滴蟲(chóng)病、大腸桿菌和沙門氏菌感染等有良好療效。但該類藥物具有細(xì)胞誘變性、動(dòng)物致癌毒性[1]，其代謝物與原藥具有相似的潛在毒性[2]，故歐盟、美國(guó)、日本等已規(guī)定甲硝唑、地美硝唑禁用于食品動(dòng)物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告對(duì)甲硝唑、地美硝唑做出規(guī)定：允許在食品動(dòng)物中使用，但是不得在動(dòng)物食品中檢出。

目前，對(duì)于動(dòng)物性食品中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法，我國(guó)目前現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 21318—2007《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗(yàn)方法》、SN/T 1928—2007《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-2-2008《動(dòng)物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-22-2008《動(dòng)物源食品中4種硝基咪唑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》等，但這些標(biāo)準(zhǔn)只適用于禽畜肉及其內(nèi)臟、水產(chǎn)品、蜂蜜、乳及乳制品，對(duì)于禽蛋中硝基咪唑類藥物殘留，缺乏相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致監(jiān)管部門在執(zhí)行禽蛋質(zhì)量安全監(jiān)管中無(wú)理可據(jù)，給監(jiān)管帶來(lái)了一定困難。

大多數(shù)硝基咪唑類藥物半衰期長(zhǎng)，在體內(nèi)吸收迅速而且完全并能保持有效濃度，蛋白結(jié)合率低，在體液和組織中分布廣泛[3]，對(duì)治療雞生殖系統(tǒng)疾病及一些傳染病引起的生殖系統(tǒng)驗(yàn)證效果好，若不遵守獸藥休藥期規(guī)定，在蛋雞產(chǎn)蛋期使用此類獸藥，可能會(huì)導(dǎo)致硝基咪唑類藥物在雞蛋中的殘留?？疾旌驼莆针u蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物的殘留情況，對(duì)建立健全我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)體系提供技術(shù)支持，為監(jiān)管部門提供監(jiān)管依據(jù)，對(duì)保障公眾的飲食安全和公共衛(wèi)生安全都具有重要的意義。為此，通過(guò)建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物展開(kāi)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

QTRAP4500三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司），配30A高效液相色譜儀（日本島津公司）；PGC753e型電子天平，艾德姆衡器（武漢）有限公司；Multi Reax型全自動(dòng)振蕩器，Heidolph公司；X3R型高速冷凍離心機(jī)，Thermo公司；Genius NM32LA型氮?dú)獍l(fā)生器，PEAK公司；ATR Autovap S60型多樣品自動(dòng)濃縮儀，力德生物科技（上海）有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)，德國(guó)Millipore公司；PRime HLB固相萃取小柱（6 mL，500 mg），美國(guó)Waters公司；MCX陽(yáng)離子交換柱（6 mL，150 mg），美國(guó)Waters公司。

1.2 試劑

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；地美硝唑（二甲硝咪唑）標(biāo)準(zhǔn)品，Bepure公司；洛硝噠唑（羅硝唑）標(biāo)準(zhǔn)品，Dr. Ehrenstorfer公司；2-甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，CATO公司；異丙硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，Dr. Ehrenstorfer公司；4-硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，Dr. Ehrenstorfer公司；苯硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，WiTEGA公司；羥基甲硝唑（甲硝唑代謝物）標(biāo)準(zhǔn)品，Bepure公司；羥甲基甲硝咪唑（洛硝噠唑、2-甲硝咪唑代謝物）標(biāo)準(zhǔn)品，WiTEGA公司；乙酸銨，色譜純，美國(guó)Tedia公司；甲酸，分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；水，超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

取約2.50 g（精確到0.01 g）均質(zhì)后的雞蛋于50 mL聚酯離心管中，加入90%乙腈水溶液至10.0 mL，渦旋振蕩10 min，在1 000 r/min條件下冷凍離心5 min。取上層提取液置于Oasis PRiME HLB固相小柱（500 mg，6 mL，無(wú)需活化）內(nèi)，以1 s/滴的速度過(guò)柱，收集4.0 mL流出液，于40 ℃氮?dú)獯蹈芍列∮?.5 mL，用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL，渦旋溶解2 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg 9種標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制成1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液。分別吸取0.1 mL至同一100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取2.50 g雞蛋樣品空白基質(zhì)，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1方法處理樣品，制得質(zhì)量濃度分別為0.5，1，5，10，20和50 ng/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK C18MGⅢ-H（3 μm，2.0 mm×100 mm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；正離子掃描模式。電噴霧電壓（IS）5 500 V；離子源溫度（TEM）550 ℃；氣簾氣（CUR）流速35 L/min；霧化氣（GS1）流速55 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速55 L/min；射入電壓（EP）10 V。

表2 9種組分的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 條件的優(yōu)化

2.1.1 儀器條件的優(yōu)化

因C18色譜柱比C8柱具有更強(qiáng)的保留性，故考察了4種不同廠家的C18色譜柱CAPCELL PAK C18MGⅢ-H（3 μm，2.0 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC? BEH C18（1.7 μm，2.0 mm×150 mm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）、Phenomenex Kinetex XB-C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）對(duì)9種待測(cè)組分的分離效果和柱效[4-5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CAPCELL PAK C18MGⅢ-H（3 μm，2.0 mm×100 mm）對(duì)9種待測(cè)組分的分離度和峰形更好，且分辨率高，因此選用該色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液等多種流動(dòng)相進(jìn)行考察。采用乙腈-0.1%甲酸水溶液時(shí)待測(cè)組分離子質(zhì)譜的分離度和響應(yīng)值最高[6-9]。所以采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式正離子進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)調(diào)節(jié)質(zhì)譜的電噴霧電壓（IS）、離子源溫度（TEM）、氣簾氣（CUR）等參數(shù)，采用響應(yīng)最強(qiáng)和次強(qiáng)的子離子分別作為定量離子和定性離子。通過(guò)梯度洗脫改變流動(dòng)相的比例，使9種待測(cè)組分達(dá)到完全分離，保留時(shí)間重現(xiàn)性好，靈敏度高，見(jiàn)圖1。

圖1 儀器條件優(yōu)化效果圖

2.1.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

雞蛋的主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，乙腈具有沉淀蛋白的作用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：90%的乙腈更利于硝基咪唑類藥物的提取，回收率較高且峰形較好，故采用90%乙腈作為提取溶劑。

PRIME HLB固相小柱填料為水可浸潤(rùn)性的親水親脂平衡共聚物，使用前無(wú)需活化和平衡，對(duì)各種蛋白、磷脂、鹽等基質(zhì)干擾物具有吸附保留作用。試驗(yàn)比較了Waters HLB固相小柱、MCX陽(yáng)離子交換固相萃取小柱和PRIME HLB固相小柱的提取效果[10-13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Waters HLB固相小柱過(guò)柱時(shí)易造成柱子堵塞，回收率低且平行性差；MCX陽(yáng)離子交換固相萃取小柱由于凈化不完全，造成基質(zhì)效應(yīng)大而導(dǎo)致回收率偏低；PRIME HLB固相小柱凈化效果好，凈化過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，提取回收率高，見(jiàn)圖2，故采用PRIME HLB固相小柱進(jìn)行凈化。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限

按試驗(yàn)方法配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用選定的儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，以待測(cè)組分定量離子濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。結(jié)果顯示，9種組分在0.5～50 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996 1～0.999 0。在雞蛋基質(zhì)空白中添加適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子按信噪比S/N=3、S/N=10分別計(jì)算檢出限和定量限，9種組分的檢出限為0.001 6～0.020 μg/kg，定量限為0.005 3～0.067 μg/kg，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 使用PRiME HLB凈化效果離子流圖

表3 雞蛋中9種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限

2.2.2 回收率和精密度

在雞蛋空白基質(zhì)中添加低、中、高3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法制備樣品并上機(jī)測(cè)定，每個(gè)濃度水平各3份，測(cè)定回收率和精密度。結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)濃度水平的回收率為86.0%～109.41%，RSD為0.41%～5.60%，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 雞蛋中9種組分加標(biāo)回收率及精密度（n=3）

2.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

為了對(duì)雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)篩查，在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市等流通領(lǐng)域共采樣82批次，采用了此次試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。4批次樣本檢出硝基咪唑類藥物，檢出率為4.88%，檢出組分為甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑，檢出甲硝唑、地美硝唑的樣品均檢出其相應(yīng)代謝物羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

動(dòng)物源性食品中獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要是采用食品安全指數(shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)的[14]，食品安全指數(shù)為每日膳食暴露量與某藥物的每日允許攝入量（ADI）的比值。其中，每日允許攝入量（ADI）是保障獸藥不對(duì)人體健康造成潛在危害的“臨界值”，是評(píng)判獸藥安全性的根本標(biāo)準(zhǔn)。每日允許攝入量（ADI）值的設(shè)置，是通過(guò)一系列嚴(yán)格且復(fù)雜的毒理學(xué)、藥理學(xué)或微生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)程序而得到的。動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留量（MRL）的設(shè)置也是通過(guò)對(duì)藥物的化學(xué)性質(zhì)、代謝、殘留實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，飲食暴露評(píng)估等確定的。甲硝唑、地美硝唑因沒(méi)有足夠數(shù)據(jù)或缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)來(lái)確定食品中該藥物或其代謝物的殘留安全水平，但是相關(guān)健康問(wèn)題已成為嚴(yán)重關(guān)注問(wèn)題，因此大部分國(guó)家對(duì)此類藥物在食品中的殘留，規(guī)定不得在食品動(dòng)物上使用該類藥物或不得在動(dòng)物食品中檢出。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定甲硝唑、地美硝唑允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出；農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告亦規(guī)定了硝基咪唑類：甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑禁止以促生長(zhǎng)的目的用于所有食品動(dòng)物。硝基咪唑類藥物在動(dòng)物食品中殘留給人體帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)已得到了有關(guān)部門的關(guān)注和重視。

對(duì)于雞蛋中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)，我國(guó)缺乏配套的標(biāo)準(zhǔn)方法。為此次雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物的風(fēng)險(xiǎn)篩查，建立了硝基咪唑類藥物及代謝物的檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于禽蛋中獸藥殘留的大批量篩查，為食品安全監(jiān)管部門提供技術(shù)支持，對(duì)雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的研究和制定提供一定的參考作用。硝基咪唑類藥物主要用于禽類感染性疾病，并具有促生長(zhǎng)作用，此類藥物在雞蛋中的殘留，可能是養(yǎng)殖戶超劑量使用或不遵守休藥期規(guī)定而導(dǎo)致的。通過(guò)對(duì)雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物的殘留風(fēng)險(xiǎn)篩查和分析，了解和掌握雞蛋中硝基咪唑類藥物殘留的現(xiàn)狀和原因，為農(nóng)業(yè)部門指導(dǎo)獸藥的科學(xué)、合理、安全使用提供依據(jù)，為食品安全監(jiān)管部門對(duì)雞蛋中獸藥殘留的監(jiān)管提供新思路，在一定程度上有利于提高雞蛋質(zhì)量安全。