冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離與性質(zhì)

趙莉君，駱震，趙改名*，黃明遠(yuǎn)，廖章伊，呂婕

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（鄭州 450002）；2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（鄭州 450000）

冷鮮牛肉滋味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，消費(fèi)量持續(xù)增加[1-2]。然而，冷鮮牛肉在流通貯藏中容易出現(xiàn)顏色劣變的問(wèn)題，降低消費(fèi)者的購(gòu)買欲望，給生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者造成大量損失[3]。導(dǎo)致冷鮮牛肉顏色劣變的因素有很多，比如光照、溫度、pH、氧分壓等[3-7]。其中一項(xiàng)關(guān)鍵因素是牛肉中氧合肌紅蛋白（MbO2）與氧結(jié)合轉(zhuǎn)化為高鐵肌紅蛋白（MMb），從而使牛肉由鮮紅色變?yōu)榘导t褐色，而高鐵肌紅蛋白還原酶（MetMbR）可以延緩這一進(jìn)程，從而阻止冷鮮牛肉顏色劣變[3-7]。

研究表明，不同品種牛肉或同一品種不同部位牛肉中高鐵肌紅蛋白還原酶的活性及性質(zhì)均有所差異[7-9]。牛肉中高鐵肌紅蛋白還原酶分離提純的方法也有所不同，常用有鹽析法、離心法、超濾法和層析法等[10-11]。Hagler等[12]早期用硫酸銨鹽析法、柱層析法分步分離提純牛心肌高鐵肌紅蛋白還原酶，為高鐵肌紅蛋白還原酶的分離純化奠定基礎(chǔ)，之后對(duì)于不同動(dòng)物、不同部位肌肉中的高鐵肌紅蛋白還原酶的提取多在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。以冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和冷鮮牛腰大肌為原料，采用硫酸銨鹽析法分別對(duì)2個(gè)部位牛肉中的高鐵肌紅蛋白還原酶進(jìn)行粗分離，并對(duì)所得粗酶液中的高鐵肌紅蛋白還原酶適宜溫度和pH進(jìn)行分析，為冷鮮牛肉中高鐵肌紅蛋白還原酶的研究提供參考，為冷鮮牛肉肉色穩(wěn)定性的提高提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

不同部位冷鮮牛肉（背最長(zhǎng)肌、腰大肌，購(gòu)自鄭州黃家牛肉連鎖店）；還原型輔酶Ⅰ二鈉、馬骨骼肌肌紅蛋白（美國(guó)Sigma公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀（天津市金瑞化工有限公司）；Premixed Protein Marker（Broad，TAKARA BIO INC）；硫酸銨、乙二胺四乙酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；2x蛋白質(zhì)上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

T10高速分散器（科冉儀器公司）；JYL-D055小型絞肉機(jī)（北京九陽(yáng)有限公司）；Pxsj-216離子計(jì)（雷磁上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；HH-601A高精度超級(jí)恒溫水浴（金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠）；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司）；Multifuge X1R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；JA2003N電子精密天平（上海江儀儀器有限公司）；JB-1A攪拌器（雷磁上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高鐵肌紅蛋白還原酶粗酶液的提取

參照王瑋[11]、Reddy等[13]的方法并稍作改進(jìn)。將肉樣切丁去筋膜，稱取5 g后攪碎，加入20 mL緩沖液，用高速分散器均質(zhì)1 min，于4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液加入800 μL高鐵氰化鉀，由鮮紅變?yōu)楹稚肝觯ń亓舴肿恿?0 000 Da）24 h，于4 ℃、10 000 r/min下離心30 min，取上清液定容到25 mL作為高鐵肌紅蛋白還原酶粗提液。

1.3.2 高鐵肌紅蛋白還原酶酶活測(cè)定

依據(jù)謝麗等[7]、王永林等[14]的方法進(jìn)行高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定。馬骨骼肌蛋白標(biāo)品每100 mg用緩沖液溶解氧化12 h后稀釋備用，配制反應(yīng)組分見(jiàn)表1，反應(yīng)溫度保持25 ℃，用水替代NADH作為空白對(duì)照，其余不變。

表1 高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定反應(yīng)組分

1.3.3 高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離

使用硫酸銨鹽析法對(duì)高鐵肌紅蛋白還原酶進(jìn)行粗分離：取制好的粗酶液加入固體硫酸銨至50%飽和度，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨，使用磁力攪拌器攪拌20 min后，于4 ℃條件下靜置2 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液加入固體硫酸銨至60%飽和度，并依此法操作至90%飽和度，對(duì)50%～90%硫酸銨飽和度的樣品沉淀（將沉淀溶于pH 7.0磷酸緩沖液中）透析脫鹽并進(jìn)行酶活測(cè)定[15]。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用分光光度法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[16]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.005 1x+0.013 9，R2=0.996 1。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

按SDS-PAGE電泳操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)[15]，其中，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，Maker的分子量范圍為6.5～200 kDa。

1.3.6 高鐵肌紅蛋白還原酶適宜pH及溫度

分別將整個(gè)反應(yīng)體系組分置于25，30，35，40和45 ℃水浴鍋中20 min，使體系在不同溫度下反應(yīng)，按照1.3.2進(jìn)行酶活測(cè)定。分別使用pH 5.5，6.0，6.5，7.0和7.5的磷酸鹽緩沖液溶解樣品后，按照1.3.2進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)部位冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性

冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌粗酶液樣品的SDSPAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌粗酶液中的蛋白分子量主要范圍在14.3～97.2 kDa之間。

冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，2個(gè)部位冷鮮牛肉的高鐵肌紅蛋白還原酶活性之間存在顯著性差異（p＜0.05）。牛背最長(zhǎng)肌中的高鐵肌紅蛋白還原酶活性明顯高于牛腰大?。╬＜0.05），與文獻(xiàn)[7]報(bào)道結(jié)果一致，這也是牛背最長(zhǎng)肌肉色穩(wěn)定性優(yōu)于牛腰大肌的原因之一。

圖1 2個(gè)部位冷鮮牛肉粗酶液的SDS-PAGE電泳圖

表2 不同部位冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果

2.2 冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離

硫酸銨鹽析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，硫酸銨飽和度不同，所得沉淀中的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間存在明顯差異（p＜0.05）。牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌均在硫酸銨飽和度為70%時(shí)，高鐵肌紅蛋白還原酶活性最高，分別為48.33和23.30 U/mL。

表3 不同硫酸銨飽和度下冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果

分步提取物中高鐵肌紅蛋白還原酶的比活力與得率見(jiàn)表4。由表4可知，經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析，冷鮮牛肉中的高鐵肌紅蛋白還原酶得到初步分離。

表4 不同部位冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶粗分離結(jié)果

2.3 冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜溫度和pH

不同溫度下，冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，試驗(yàn)范圍內(nèi)，30～45 ℃冷鮮牛背最長(zhǎng)肌的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間無(wú)明顯差異（p＞0.05）。溫度不同，冷鮮牛腰大肌的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間存在顯著性差異（p＜0.05）。冷鮮牛腰大肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性適宜的反應(yīng)溫度為35 ℃。

表5 不同溫度下冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果

不同pH下，冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，試驗(yàn)范圍內(nèi)，冷鮮牛背最長(zhǎng)肌高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜pH為6.5（p＜0.05）。pH不同，冷鮮牛腰大肌的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間存在顯著性差異（p＜0.05）。冷鮮牛腰大肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性的適宜pH為6.0～6.5。

表6 不同pH下冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶的活性分別為94.33和53.60 U/mL。經(jīng)硫酸銨鹽析，冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶可得到粗分離，適宜的硫酸銨飽和度為70%。冷鮮牛背最長(zhǎng)肌和牛腰大肌高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜溫度分別為30～45 ℃和35℃，適宜pH分別為pH 6.5和pH 6.0～6.5。