梗膏酶處理工藝參數(shù)的優(yōu)化

李鋒，樸永革，付祺，劉友杰，李河霖，段賓賓*

1. 吉林煙草工業(yè)有限責任公司（長春 130031）；2. 云南瑞升煙草技術（集團）有限公司（昆明 650106）

煙梗是卷煙生產中的重要副產物，是傳統(tǒng)造紙法再造煙葉的主要原料之一，其占葉重的比例25%～35%[1]。傳統(tǒng)再造煙葉涂布料中煙梗提取物（以下簡稱梗膏）用量占比約為40%～50%，對產品品質有較大影響。由于煙梗中含有一些對感官品質不利的成分，主要有木質素、纖維素、果膠、蛋白質等大分子物質，煙梗水浸提后，梗膏中仍會保留這些不利成分，給產品帶來熱辣、點刺、發(fā)苦、辛辣等抽吸方面的不足，同時木質雜氣突出。因此，研究梗膏的使用性能進而對提升再造煙葉品質具有極大的應用價值[2-3]。

為提升梗膏的使用性，有不少關于酶制劑處理煙梗，從而提升煙梗纖維性能的報道[4]。而對梗膏的研究報道較少，主要集中在微生物發(fā)酵和美拉德反應上，均能有效增加梗膏中的致香成分，提升產品抽吸品質[5-6]。正交試驗廣泛應用于卷煙行業(yè)，主要用來優(yōu)化相關工藝技術參數(shù)，是一種高效、快速研究多因素多水平的設計方法[7]。試驗選用木瓜蛋白酶和多酚氧化酶對梗膏進行處理，以氨基酸態(tài)氮含量指標來優(yōu)化酶處理梗膏的工藝參數(shù)，意在得出酶處理最優(yōu)工藝參數(shù)，以期改善梗膏的內在品質，提高梗膏利用率。其中，木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的的水解能力；多酚氧化酶是酶促棕色化反應的介導物，梗膏中多酚類物質的降解物可增加香氣量，對改善梗膏品質有重要作用；氨基酸態(tài)氮指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，一定程度上可表征梗膏的抽吸品質[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

葉膏、梗膏和基片（吉林煙草工業(yè)有限責任公司）；基料（云南瑞升煙草技術（集團）有限公司）；木瓜蛋白酶和多酚氧化酶（寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司）。

DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；AL204型天平（感量0.000 1 g，Mettler-Toledo Group）；SHA-B 2002型恒溫水浴振蕩器（常州國華電器有限公司）；754型紫外可見分光光度計（上海精密化學儀器有限公司）；pH計。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

由于酶具有專一性，且對液體pH環(huán)境要求較高，而梗膏一般為pH 6.5，生產過程中難以使用相關化學試劑對液體pH進行調節(jié)，而木瓜蛋白酶和多酚氧化酶在梗膏自身pH環(huán)境下，可達到最優(yōu)處理，即不需要對梗膏pH環(huán)境進行調節(jié)。

先添加木瓜蛋白酶對梗膏進行水浴振蕩處理，得到梗膏T1，在梗膏中繼續(xù)添加多酚氧化酶進行水浴振蕩處理，得到梗膏T2。分別檢測T1和T2梗膏中氨基酸態(tài)氮含量。（試驗不進行滅活處理）。

1.2.2 正交試驗設計

在不考慮交互作用的情況下，依據(jù)正交試驗設計原理，分別對木瓜蛋白酶和多酚氧化酶的活力濃度、酶解時間和酶解溫度作為試驗因素，各設置3個水平，木瓜蛋白酶各因素三水平分別標識為1、2、3，多酚氧化酶各因素三水平分別標識為11、12、13，其他工藝參數(shù)保持不變，選用正交設計表L9(34)進行表頭設計，以氨基酸態(tài)氮含量作為檢測指標，優(yōu)化酶處理工藝。試驗參數(shù)設計見表1。

表1 正交試驗各因素水平表

1.2.3 化學成分測定

由云南同創(chuàng)分析檢測中心測定。

常規(guī)化學成分中的水溶性總糖、總植物堿、蛋白質等按標準[11-13]測定；氨基酸態(tài)氮采用比色法[14]測定。

1.2.4 感官評吸

將未處理的梗膏和最優(yōu)酶處理的梗膏分別取適量，與葉膏、基料質量比5∶4∶1，配成涂布液均勻涂布于再造煙葉基片上，控制涂布率為30%，制成樣品。將制備所得樣品在溫度22±1 ℃和相對濕度60%±2%的平衡室中平衡48 h，邀請云南瑞升煙草技術（集團）有限公司的卷煙感官評吸小組（共5人）進行感官品質評吸。以標準GB 5606.4—2005《卷煙第四部分：感官技術要求》為基礎[15]，評吸指標包括嗅香、諧調、香氣量、香氣質、雜氣、余味和刺激性等指標，各指標按評吸品質檔次分別給予不同的分值，并計算評吸品質總分。

2 結果與分析

2.1 正交設計試驗結果

正交試驗結果見表2，由極差分析可知，木瓜蛋白酶處理梗膏試驗中，各因素對氨基酸態(tài)氮含量影響大小順序為RC＞RA＞RB，即酶解溫度＞木瓜蛋白酶活力濃度＞酶解時間。正交試驗結果顯示梗膏酶處理最佳條件為A2B3C2，即木瓜蛋白酶處理梗膏最優(yōu)工藝條件為：酶活力濃度3 000 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度55 ℃。

多酚氧化酶處理梗膏試驗中，各因素對氨基酸態(tài)氮含量影響大小順序為RA＞RB＞RC，即多酚氧化酶活力濃度＞酶解時間＞酶解溫度。正交試驗結果顯示梗膏酶處理最佳條件為A11B13C11，即多酚氧化酶處理梗膏最優(yōu)的工藝條件為：酶活力濃度300 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度50 ℃。

表2 正交試驗方案及極差分析

方差分析表明（表3），T1（木瓜蛋白酶）總模型p=0.025，在α=0.05水平上有顯著影響。因素A（酶活力濃度）和因素B（酶解時間）對梗膏中氨基酸態(tài)氮含量影響不顯著，因素C（酶解溫度）對梗膏中氨基酸態(tài)氮含量影響極顯著（α=0.01）。因此在木瓜蛋白酶處理梗膏中，應嚴格控制木瓜蛋白酶處理梗膏的溫度。

T2（多酚氧化酶）總模型p=0.139，因素A（酶活力濃度）、因素B（酶解時間）和因素C（酶解溫度）均對梗膏中氨基酸態(tài)氮含量影響不顯著。

根據(jù)木瓜蛋白酶和多酚氧化酶各因素的影響結果，結合生產實際操作的便捷性及能耗要求，對兩種酶處理條件進一步優(yōu)化。將木瓜蛋白酶的酶解時間由120 min降低為60 min，將多酚氧化酶的酶解溫度由50℃增加為55 ℃，其他最優(yōu)工藝指標不變，即木瓜蛋白酶處理梗膏的最優(yōu)工藝條件為A2B1C2，多酚氧化酶處理梗膏的最優(yōu)工藝條件為A11B13C12。

2.2 運行效果驗證及化學常規(guī)分析

為進一步檢驗試驗方法的可靠性，驗證優(yōu)化酶處理梗膏的工藝條件，選取木瓜蛋白酶活力濃度3 000 U/mL，酶解時間60 min，酶解溫度55 ℃；多酚氧化酶活力濃度300 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度55℃，對煙梗進行酶處理，重復試驗3次，實際測得氨基酸態(tài)氮含量為2.25%，驗證試驗結果與理論預測值誤差在1%以內。因此，通過正交試驗法優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)準確可靠。

現(xiàn)將經過最優(yōu)工藝酶處理的梗膏樣品與葉膏、基料等配合使用，制成再造煙葉試驗樣品，與未經處理的梗膏同樣條件下制備的再造煙葉在相關化學成分上進行對比，結果如表4所示。

表3 方差分析檢驗結果

表4 不同處理樣品化學成分檢測結果

經過酶處理的試驗樣水溶性總糖和總植物堿含量均有不同程度的增加，蛋白質含量有所降低。樣品中蛋白質含量降低可能是由于在梗膏中添加外援酶制劑，有效降解蛋白質、多肽等大分子為小分子氨基酸態(tài)氮，在最后制備樣品時，達到降低蛋白質的目的。施木克值一般可反映煙葉中的酸堿平衡關系，經驗證明，施木克值在2以內越高煙草品質越好。因為可溶性總糖量過高煙氣產生的酸性過強，刺激越大，且含氮物質過少，香氣往往不足。糖堿比也是衡量煙葉品質的另一重要指標，一般以6～10為宜[16-17]?？梢姡涍^酶處理后的再造煙葉樣品品質明顯提高。

2.3 感官評價

評吸結果表明（見表5）：經過酶處理的試驗樣，感官抽吸品質在香氣質、香氣量、雜氣、余味、刺激性和協(xié)調性上均有明顯改善?？梢?，梗膏經過酶處理后，制備的再造煙葉產品，抽吸品質明顯提升。

表5 感官評價結果

3 結論與討論

采用木瓜蛋白酶和多酚氧化酶先后對梗膏進行酶處理，以氨基酸態(tài)氮含量為指標采用正交試驗法優(yōu)化其工藝參數(shù)，最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶活力濃度3 000 U/mL，酶解時間60 min，酶解溫度55 ℃；多酚氧化酶活力濃度300 U/mL，酶解時間120 min，酶解溫度55 ℃。在此條件下，氨基酸態(tài)氮含量為2.25%。酶處理后的梗膏能明顯改善和修飾再造煙葉香氣，提高再造煙葉產品煙氣的甜潤感，降低雜氣和刺激性，使煙香協(xié)調。

對梗膏的研究主要有3方面：微生物發(fā)酵、酶處理以及美拉德反應。段焰青等[18]、張勃等[19]均對煙草內生菌進行菌株培養(yǎng)，對梗膏進行發(fā)酵處理，處理后的梗膏，可明顯降低刺激、增加香氣，提升產品品質。駱莉等[20]采用生物酶和微生物對煙梗提取液的性質進行改良，結果發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵后再進行美拉德反應，使梗膏中還原糖、氨基態(tài)氮和揮發(fā)物質均有所增加，提升了產品品質。試驗運用正交試驗設計工具，對復合酶解工藝條件進行研究，經酶處理的梗膏，協(xié)調了自身化學成分，同時增加氨基酸態(tài)氮的含量，有效提高梗膏的抽吸品質。可見復合酶處理梗膏提質的方法可行，后續(xù)將深入研究酶處理對梗膏在再造煙葉中的提質作用，提高梗膏的實際利用率。因此，試驗確立的復合酶處理梗膏最優(yōu)工藝參數(shù)，是一種可行、有效的處理方法，有利于提升梗膏抽吸品質，進一步優(yōu)化再造煙葉的內在品質。