鹽脅迫對2個八棱海棠株系生長與光合熒光特性的影響

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（1.河北省農(nóng)林科學院 a.濱海農(nóng)業(yè)研究所；b.河北省鹽堿地綠化技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 唐山 063299；2.國家林業(yè)和草原局鹽堿地中心，北京 100091；3.河北農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境科學學院，河北 保定 071001）

土壤鹽漬化已成為全球重要的資源與環(huán)境問題，每年造成全球農(nóng)業(yè)減產(chǎn)超過273 億美元[1]。我國鹽漬化土壤面積近1 億hm2，由于工業(yè)污染、不合理的農(nóng)業(yè)灌溉、施肥等原因引起的次生鹽漬化土壤面積仍在不斷擴大[2]，導致現(xiàn)今人口增長與耕地減少的矛盾日益突出，鹽漬土特別是濱海鹽漬土作為一種重要的土地后備資源，亟待開發(fā)利用[3]。前人研究表明，與工程避鹽、化學治鹽相比，生物治鹽，即利用耐鹽植物尤其是耐鹽林木，改良鹽漬土，具有投資小、適用范圍廣、可持續(xù)性強等優(yōu)點，已成為鹽漬化土壤改良與利用的有效途徑，越來越引起人們的重視[4-5]。因此，篩選、培育耐鹽林木資源，研究其耐鹽機理對于開發(fā)利用濱海鹽漬土資源、緩解土地資源短缺具有重大理論和現(xiàn)實意義。

八棱海棠Malus robustaRehd.又名懷來海棠，屬薔薇科仁果亞科西府海棠種，是我國栽培歷史悠久的樹種之一。八棱海棠根系發(fā)達，植株強壯，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特點，是傳統(tǒng)的蘋果砧木[6]。另外，八棱海棠樹姿優(yōu)美、開花量大，色彩豐富，觀賞價值極高，因此，成為園林綠化、美化的常用樹種[7]。前人對八棱海棠進行了大量的研究，大多集中在比較八棱海棠與其他蘋果砧木的抗逆性方面[8-10]，均得出八棱海棠相較于其他蘋果砧木具有更強的抗逆性。八棱海棠為高度雜合種，在生產(chǎn)上多采用實生繁殖，常會產(chǎn)生廣泛的性狀分離現(xiàn)象。林冰冰等[11]在對蘋果實生砧木種質(zhì)資源耐缺鐵和耐鹽堿性評價研究中發(fā)現(xiàn)八棱海棠重要抗性的遺傳多樣性不僅存在于居群間，甚至株系間也存在顯著差異。宗鵬鵬等[12]以八棱海棠實生苗材料進行不同濃度的鹽堿脅迫，亦得出八棱海棠實生苗中存有廣泛的抗性分離現(xiàn)象，存有極強的耐鹽植株，是優(yōu)異的耐鹽堿型種質(zhì)資源。綜上所述，八棱海棠是一種抗逆性較強的林木，株系內(nèi)存有廣泛的抗性分離現(xiàn)象，有極強的耐鹽植株，但關(guān)于極強耐鹽株系的耐鹽機理的研究尚未見報道。在眾多被鹽脅迫抑制的細胞機能中，光合作用是植物對鹽脅迫響應(yīng)最敏感的生理過程，在其他植物上已有不少報道[13-14]，關(guān)于鹽脅迫對八棱海棠株系光合特性的影響的研究卻鮮見報道。

本研究分別以耐鹽類型的八棱海棠[7]（編號為NY）及普通類型的八棱海棠（編號為PT）植株組培出的無性系苗為試材進行鹽脅迫試驗，通過研究鹽脅迫下2 株系的生長、葉片光合、葉綠素熒光參數(shù)的變化情況，確定2 株系的耐鹽閾值并揭示2 株系在鹽脅迫下光合熒光的變化規(guī)律，以期為八棱海棠在鹽漬地區(qū)的應(yīng)用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為同期增殖、生根、煉苗后長勢相對一致，已移栽至營養(yǎng)缽中的2月齡八棱海棠耐鹽植株（NY）與普通植株（PT）的組培苗。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年9—10月在河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所耐鹽鑒定池內(nèi)進行，采用盆栽過量灌溉鹽溶液的方法，將長勢相對一致、高12 cm 左右的2 種無性系幼苗移栽至裝有蛭石和草炭混合基質(zhì)（體積比1∶1）的上口徑和高分別為28 與30 cm 的聚乙烯塑料花盆內(nèi)，每盆4 棵，每個株系栽植21 盆，放于遮陽棚內(nèi)緩苗。每天過量澆灌Hoagland 營養(yǎng)液并進行日常養(yǎng)護管理。緩苗10 d 后，每個株系挑選生長表現(xiàn)良好且相對一致的18 盆幼苗用于鹽脅迫試驗。試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，以Hoagland 營養(yǎng)液為基礎(chǔ)液配制6 個質(zhì)量濃度（0、2、4、6、8、10 g/L）的NaCl 溶液，每處理3 盆（即3 個重復，每個處理共計12 株苗），每天過量灌溉相應(yīng)NaCl 質(zhì)量濃度的Hoagland 營養(yǎng)液，鹽脅迫處理40 d 后結(jié)束試驗。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標的測定

鹽脅迫處理前測量并記錄每處理植株的株高H0（用卷尺測量）和地徑D0（用數(shù)顯游標卡尺測量），試驗結(jié)束后再次測量并記錄植株的株高和地徑。用電子天平稱量植株地上鮮質(zhì)量。

1.3.2 光合色素含量的測定

采集距植株主干頂部第5 ～6 片功能葉片帶回實驗室，用乙醇提取、分光光度計測定吸光值法[15]，測定各處理葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和總?cè)~綠素含量。

1.3.3 光合參數(shù)的測定

在晴朗無風的09:00—11:00 采用LI-6400 便攜式光合儀的標準葉室，設(shè)定紅藍LED 光源，光強設(shè)為1 000 μmol/(m2·s)，開放式氣路，流速設(shè)定為500 μmol·s-1。測定距植株主干頂部5 ～6 片功能葉片的凈光合速率（Pn）、葉片氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）等光合指標，每處理各測定6個葉片。按下式[16]計算氣孔限制值（Ls）：

Ls=(Ca-Ci)×100%/Ca。

式中：Ca為大氣CO2濃度。

1.3.4 葉綠素熒光參數(shù)的測定

采用LI-6400 便攜式光合儀的熒光葉室測定各處理葉片的葉綠素熒光參數(shù)，葉片選擇同1.3.3。葉片經(jīng)暗處理30 min 后，測定初始熒光（F0）、最大熒光（Fm）；光活化30 min 后，測定光適應(yīng)下的最小熒光（F0′）、最大熒光（Fm′）、穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）、電子傳遞效率（ETR），每處理各測定6 個葉片。計算最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學量子效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數(shù)（qP）、非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進行oneway ANOVA 方差分析，并用Duncan 方法進行多重比較，用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗生長的影響

不同濃度鹽脅迫對八棱海棠幼苗生長指標的測定結(jié)果見表1。由表1可知，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，2 株系的株高增量、地徑增量及地上鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)下降的趨勢。當NaCl 質(zhì)量濃度為4 g/L時，與對照相比，2 株系的株高增量、地徑增量及地上鮮質(zhì)量均顯著下降。隨著NaCl 質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，各生長指標值進一步減少，當NaCl 質(zhì)量濃度為8 g/L 時，NY 株系的上述生長指標比對照分別減少59.38%、55.62%、70.36%，PT 株系上述生長指標較對照分別減少83.72%、83.33%、84.01%。當NaCl 質(zhì)量濃度為10 g/L 時，PT 株系各幼苗全部脅迫致死。高鹽（8 g/L）脅迫條件下，2 株系幼苗生長均受到較嚴重的抑制，PT 株系受抑制程度高于NY 株系。

表1 不同濃度鹽脅迫對八棱海棠幼苗生長的影響?Table1 Effects of salt stress at different concentrations on the growth of two strains of Malus robusta Rehd.

耐鹽閾值是指植株生長量為對照植株生長量1/2 時的鹽濃度，以植株地上鮮質(zhì)量為因變量（y），以NaCl 質(zhì)量濃度為自變量（x），通過曲線估計，建立兩種海棠的回歸方程，結(jié)果表明，耐鹽海棠植株鮮質(zhì)量與NaCl 質(zhì)量濃度符合線性模型，方程為：y=-1.794x+20.883，R2=0.983。普通海棠植株鮮質(zhì)量與NaCl 質(zhì)量濃度也符合線性模型，方程為：y=-2.347x+20.513，R2=0.966。以植株鮮質(zhì)量較對照下降50%為準，算得NY 株系的耐鹽閾值為6.0 g/L，PT 株系的耐鹽閾值為4.1 g/L，說明NY 株系的耐鹽性強于PT 株系。

2.2 鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗光合色素含量的影響

不同濃度鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗光合色素含量的影響情況見表2。由表2可知，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，2 株系葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及總?cè)~綠素的含量均呈現(xiàn)下降的趨勢。在NaCl 質(zhì)量濃度低于6 g/L時，各處理的上述指標與對照差異均不顯著，說明中低濃度對2 株系葉綠素的影響均不大；NaCl質(zhì)量濃度為8 g/L 時，NY 株系的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總?cè)~綠素含量較對照分別下降了15.56%、42.22%、14.41%、26.72%。PT 株系的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總?cè)~綠素含量比對照則分別下降了30.85%、40.00%、17.94%、32.88%，除了葉綠素b 含量，NY 株系其他各指標值的下降幅度均小于PT 株系，說明在高鹽脅迫下NY 株系具有更強的保持葉綠素相對穩(wěn)定的能力。

表2 不同濃度鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗光合色素含量的影響Table2 Effects of salt stress at different concentrations on chlorophyll content of two strains of M.robusta Rehd．

2.3 鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗光合氣體交換參數(shù)的影響

光合作用為植物體內(nèi)重要的代謝過程，是植物生長的物質(zhì)和能量來源。不同濃度的鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗光合參數(shù)的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，2 株系幼苗的Pn、Gs、Tr均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在NaCl 質(zhì)量濃度低于4 g/L 時，NY 株系的上述各指標均迅速下降；當NaCl 質(zhì)量濃度高于4 g/L 時，其各指標值均在較低水平上緩慢變化；當NaCl 質(zhì)量濃度為8 g/L 時，Pn、Gs、Tr較對照分別下降了59.92%、77.85%、68.04%。隨著NaCl 質(zhì)量濃度的升高，PT 株系的Pn、Gs、Tr均迅速下降；當NaCl質(zhì)量濃度為8 g/L 時，Pn、Gs、Tr較對照分別下降了94.64%、67.22%、61.25%。在高于4 g/L 的NaCl 質(zhì)量濃度的鹽脅迫下，NY 株系能夠維持相對較低的Pn緩慢變化，這應(yīng)該是NY 株系在高鹽脅迫下仍能存活的原因之一。

影響Pn大小的因素除了Gs、Tr外，還有Ci和Ls等，這些指標在植物光合作用過程中協(xié)同作用，使得光合作用能夠順利進行。隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，2 株系的Ci和Ls呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，NY 株系的Ci呈現(xiàn)下降的趨勢，Ls呈現(xiàn)升高的趨勢；PT 株系則相反，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，Ci呈現(xiàn)升高的趨勢，而Ls呈現(xiàn)下降的趨勢。這一結(jié)果說明，鹽脅迫引起2 株系Pn下降的主要限制因素不同。

2.4 鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)可以準確反映PS Ⅱ的狀態(tài)。不同濃度鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響情況見表3。由表3可知，當NaCl質(zhì)量濃度低于4 g/L 時，2 株系各熒光參數(shù)的變化均不顯著，說明低于4 g/L 的NaCl 脅迫對2 株系葉片的ΦPSⅡ的影響均不大；隨著NaCl 質(zhì)量濃度的進一步增加，2 株系葉片的最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光能轉(zhuǎn)換效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數(shù)（qP）、電子傳遞效率（ETR）均逐漸降低，非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）呈現(xiàn)升高的趨勢。當NaCl 質(zhì)量濃度為8 g/L 時，NY 株系葉片的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、ETR 較對照分別下降了9.21%、24.01%、12.79%、24.17%，NPQ 增加了47.76%；PT 株系葉片的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、ETR 較對照分別下降了12.16%、39.13%、34.04%、39.10%，NPQ 增加了25.14%。NY 株系葉片的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP的下降幅度均小于PT 株系，說明鹽脅迫對NY 株系葉片的PSII的影響相對較小。

圖1 不同濃度的鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗光合參數(shù)的影響Fig.1 Effects of salt stress at different concentrations on photosynthetic parameters of two strains of M.robusta Rehd．

3 結(jié)論與討論

植株生長指標和生物量的變化是植物對鹽脅迫的綜合體現(xiàn)，也是判斷植物耐鹽性最直觀的指標[10,15-16]。對于鹽生植物來說，較低濃度的鹽處理不僅不會對植物造成抑制，甚至會促進植物的生長[17]，如在研究鹽脅迫對鹽地堿蓬[18]、白刺[19]的影響中就表現(xiàn)出上述現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫抑制了2 株系八棱海棠的生長，低濃度（2 g/L）鹽脅迫雖對2 株系的影響均不顯著，但起到了一定的抑制作用，4 g/L 的鹽脅迫顯著抑制了2 株系的生長，說明八棱海棠相比于鹽生植物對鹽脅迫更為敏感，這與慕德宇等[20]對白榆，馬劍等[21]對文冠果的耐鹽研究結(jié)論一致?？赡苁怯捎邴}脅迫程度的增強，植株營養(yǎng)組織器官不僅不能正常維持原有生理活動，還需要消耗更多的能量、有機物質(zhì)和水分來維持其抗逆生理，進而抑制植株生長[14]。高鹽脅迫下，PT 株系各生長指標值的下降比例高于NY 株系，且求得的NY 株系的耐鹽閾值為6.0 g/L，PT 株系的耐鹽閾值為4.1 g/L，這進一步證明了NY 株系的耐鹽性強于PT 株系。

表3 不同濃度鹽脅迫對八棱海棠2 株系幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響Table3 Effects of Salt Stress at different concentrations on Chlorophyll Fluorescence parameters of two strains of M.robusta Rehd.

光合色素含量與植物光合作用密切相關(guān)，是衡量植物抗逆性的重要生理指標之一[14,22]。試驗結(jié)果表明，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，八棱海棠2 株系的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素以及總?cè)~綠素的含量均呈現(xiàn)減少的趨勢，在NaCl 質(zhì)量濃度低于6 g/L 時，各處理指標與對照的差異均不顯著，說明低鹽脅迫對2 株系八棱海棠的光合色素的影響均較小，高鹽（8 g/L）脅迫時，PT 株系的各光合色素指標均顯著低于對照水平，NY 株系僅有葉綠素b 和總?cè)~綠素含量顯著低于對照，說明高鹽脅迫下NY 株系比PT 株系具有更強保持光合色素穩(wěn)定的能力。光合色素含量下降的原因可能為，鹽脅迫對葉綠體結(jié)構(gòu)造成了一定的破壞，增加了葉綠素酶的活性，促進了光合色素的分解[23]。分析2 株系各色素的變化規(guī)律可發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下葉綠素b 的變化幅度大于其他光合色素，可見2株系的葉綠素b對鹽脅迫更為敏感，這與張瑞等[24]、盧艷等[25]在研究鹽脅迫對蘋果不同砧穗組合影響時的結(jié)果一致。

光合作用是一個復雜的生理過程，Pn直接反映了植物單位葉面積的同化能力，是衡量植物光合能力的重要指標。本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫顯著抑制了2 株系八棱海棠的Pn、Gs和Tr，與前人對鹽脅迫下的金銀花[17]和‘吉美’海棠[13]的研究結(jié)果一致。高鹽脅迫下，NY 株系的凈光合速率下降幅度小于PT 株系，說明高鹽脅迫下，NY 株系具有更強制造有機物的能力。一般認為，引起植物葉片Pn下降的因素主要分為兩類：若伴隨著Pn的下降，Ci下降、Ls升高，為氣孔限制（氣孔部分關(guān)閉）；若伴隨著Pn的下降，Ci升高、Ls下降，則為非氣孔限制[26]。非氣孔限制主要是指由于RuBP 羧化酶效率降低和光合作用表觀量子效率下降導致光合速率下降[27]。試驗結(jié)果表明，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的升高，NY 株系的Pn逐漸下降，同時伴隨著Ci下降、Ls升高，說明NY 株系Pn下降的主要因素是氣孔限制，由此可以推知，由于鹽脅迫引起了滲透脅迫，使得氣孔導度下降，CO2由外界向細胞內(nèi)擴散的阻力增強，最終導致光合作用受阻。PT 株系的Pn逐漸下降的同時伴隨著Ci升高、Ls下降，說明PT 株系Pn下降的主要因素為非氣孔限制，由此可以推知，由于高鹽脅迫下細胞呼吸作用短暫加強，從而細胞中積累了過量鹽離子，破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)和葉片光合器官，造成葉綠素含量降低、葉片光合活性下降。

葉綠素熒光是光合作用的探針，任何環(huán)境因子對光合作用的影響都可以通過葉綠素熒光參數(shù)的變化反應(yīng)出來[28]。Fv/Fm是用來反映PS Ⅱ是否受到光抑制或者光破壞的參數(shù)；qP指由于光化學反應(yīng)引起的熒光產(chǎn)量降低，一定程度上代表反應(yīng)中心的開放程度；NPQ 指因非光化學反應(yīng)引起熒光產(chǎn)量降低，一般用于表示熱耗散的多少[28-29]。試驗結(jié)果表明，當NaCl 質(zhì)量濃度低于4 g/L 時，各熒光參數(shù)變化不顯著，高濃度（8 g/L）鹽脅迫下，F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ顯著下降，且PT 株系Fv/Fm、ΦPSⅡ下降幅度高于NY 株系，說明高鹽脅迫使2 株系發(fā)生了光抑制現(xiàn)象，并且PT 株系對高鹽脅迫更為敏感。隨著鹽濃度不斷升高，qP和ETR 均呈現(xiàn)下降趨勢，NPQ 呈現(xiàn)升高的趨勢，NY 株系NPQ 升高幅度遠大于PT 株系，說明鹽脅迫降低了2 株系的光合活性，增加了2 株系葉片的電子傳遞阻力，改變了2 株系葉片PS Ⅱ激發(fā)能的分配方式，2 株系通過增加熱耗散來消耗過多激發(fā)能，從而緩解鹽脅迫對PS Ⅱ造成的傷害。在高鹽脅迫下，NY株系具有更強的耗散過剩激發(fā)能的能力，從而實現(xiàn)更好的自我保護。

本試驗雖然明確了鹽脅迫對八棱海棠幼苗生長和光合生理特性的影響，但八棱海棠對鹽脅迫更深層次的光合響應(yīng)機理尚不清楚，今后應(yīng)從基因、蛋白、代謝等多方面更深入地研究八棱海棠的耐鹽機理，從而明確鹽脅迫下，植株是通過調(diào)節(jié)哪些光合系統(tǒng)相關(guān)基因、蛋白和代謝產(chǎn)物來提高其耐受性，為鹽漬地區(qū)的八棱海棠應(yīng)用提供更強有力的理論依據(jù)。

綜合上述研究，可以歸納出如下兩點結(jié)論：1）鹽脅迫抑制了2 株系八棱海棠的生長，降低了葉綠素含量、光合速率，使PSⅡ發(fā)生了光抑制現(xiàn)象；將2 個株系進行比較，鹽脅迫對NY 株系的抑制影響相對較小，NY 株系的耐鹽閾值為6.0 g/L，PT株系的耐鹽閾值為4.1 g/L，進一步明確了NY 株系的耐鹽性強于PT 株系。2）推測NY 株系具有更強耐鹽性的光合生理的原因為：高鹽脅迫下，NY 株系具有更強的保持光合色素穩(wěn)定、調(diào)節(jié)過剩激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱耗散的能力，從而減輕鹽脅迫對其造成的傷害。