紅樹莓葉片早衰對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分含量和主要酶活性的影響

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（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省核桃工程技術(shù)研究中心，河北 邢臺(tái) 054000）

紅樹莓Rubus idaeus為薔薇科懸鉤子屬Rubusspp.的多年生落葉小灌木，又名托盤、紅馬林，中草藥名稱“覆盆子”[1]。樹莓在世界上被譽(yù)為“黃金水果”“水果之王”[2]，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的健康小漿果果樹，被譽(yù)為“第3 代小漿果”[3]，有生態(tài)效益好、抗病蟲性強(qiáng)、投資效益高、管理簡(jiǎn)便、產(chǎn)業(yè)延伸鏈條長(zhǎng)、市場(chǎng)范圍廣[4]等優(yōu)點(diǎn)。有研究結(jié)果表明，紅樹莓可以增強(qiáng)人體免疫力[5]、抗衰老[6-7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、降血脂[10]，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。紅樹莓雙季品種‘海爾特茲’表現(xiàn)優(yōu)良，但在部分植株上出現(xiàn)葉片早衰的現(xiàn)象。劉海鵬等[11]通過研究不同時(shí)期早衰‘海爾特茲’紅樹莓不同部位的不同礦質(zhì)元素含量與正常紅樹莓的差異，發(fā)現(xiàn)紅樹莓葉片早衰是由缺氮、磷、鎂、鐵引起的。國(guó)內(nèi)外對(duì)紅樹莓的研究主要集中在紅樹莓加工生產(chǎn)[12-14]、貯藏保鮮方法[15-17]、栽培修剪措施[18-19]、病蟲害防治[20]等方面。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，紅樹莓年生長(zhǎng)周期中果實(shí)成熟盛期，生殖生長(zhǎng)的同時(shí)伴隨營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，尤其是果實(shí)大量成熟期，這一時(shí)期不同初生莖進(jìn)入生殖生長(zhǎng)的發(fā)育狀態(tài)不同，初生莖對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需求及葉片外在衰老表現(xiàn)亦有較大差異，葉片早衰嚴(yán)重影響果實(shí)發(fā)育，表現(xiàn)為果實(shí)小、單果小核果數(shù)量減少等，嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)。因此，亟待進(jìn)行紅樹莓果實(shí)成熟盛期初生莖不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)變化的研究。本研究中對(duì)同一時(shí)期不同發(fā)育階段‘海爾特茲’紅樹莓葉片主要礦質(zhì)元素含量及主要酶活性變化進(jìn)行研究，以期為紅樹莓合理施肥及延緩葉片早衰提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

2018年8月，在河北省邢臺(tái)市內(nèi)丘縣紅樹莓園區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)地屬冀中平原地區(qū)，海拔30 ～50 m，溫帶大陸性季風(fēng)氣候明顯，年平均氣溫13.2 ℃，年平均降水量499.6 mm，無霜期196 d。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為5年生‘海爾特茲’紅樹莓，株行距為0.5 m×2.0 m，株高1.3 ～1.4 m。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集與處理

隨機(jī)選取同一時(shí)期不同發(fā)育階段、不同早衰程度的紅樹莓初生莖，采集葉片。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（VGS），無花序，葉片生長(zhǎng)正常且無任何早衰現(xiàn)象；初花期（PFS），初生莖花序量25% ～30%，葉片25%～30%發(fā)生早衰；盛花期（FFS），花序量70%～80%，葉片40%～50%發(fā)生早衰；果實(shí)成熟初期（PRS），25%～30%果實(shí)成熟，葉片60%～65%發(fā)生早衰；果實(shí)成熟盛期（FRS），70%～80%果實(shí)成熟，葉片70%～80%發(fā)生早衰。分別在同一時(shí)期采集不同發(fā)育階段樹體上部和下部的葉片，每個(gè)階段各取100 片葉，3 次重復(fù)。除營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（VGS），其他階段僅采集早衰葉片。采下的葉片迅速帶回室內(nèi)，然后依次使用自來水—0.1%洗滌劑溶液—自來水—自來水—0.2%鹽酸溶液—蒸餾水—無離子水—無離子水進(jìn)行漂洗。于105 ℃恒溫殺青20 min 后，80 ℃烘至恒質(zhì)量。然后用不銹鋼粉碎機(jī)粉碎，使其全部通過0.5 mm 的篩子，放于信封中，置干燥器內(nèi)于陰涼干燥處保存。

1.3.2 測(cè)定方法

氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定[21]，磷含量采用鉬銻鈧比色法[22]測(cè)定，微量元素含量使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定[23]。過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[24]，過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫法測(cè)定[25]，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定[26]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定[27]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用DPS 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹莓不同早衰程度葉片中礦質(zhì)元素含量

2.1.1 紅樹莓不同早衰程度葉片中大量礦質(zhì)元素含量

在同一時(shí)期，紅樹莓不同早衰程度葉片中大量礦質(zhì)元素含量如圖1所示。由圖1可見，樹體下部葉片氮元素含量變化明顯，其變化范圍是4.67 ～6.58 g/kg，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期，氮元素含量下降明顯。樹體上部葉片磷元素含量變化范圍是0.64 ～0.85 g/kg，樹體下部葉片磷元素含量變化范圍是0.65 ～0.76 g/kg，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期均下降明顯，在果實(shí)成熟盛期早衰葉片中維持穩(wěn)定。樹體上、下部葉片鉀元素含量變化范圍分別是5.47 ～8.68 和5.63 ～8.09 g/kg，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期均明顯下降，正常葉片中鉀元素含量顯著高于早衰葉片。鈣、鎂元素含量變化趨勢(shì)基本相同，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期均有微幅上漲，樹體上、下部葉片鈣元素含量的變化范圍分別是14.76 ～30.52 和32.52 ～44.58 g/kg，樹體上、下部葉片鎂元素含量變化范圍分別是14.50 ～27.87 和12.71 ～32.91 g/kg，正常葉片中鈣、鎂含量顯著低于早衰葉片（P＜0.05）。

圖1 紅樹莓不同早衰程度葉片中大量礦質(zhì)元素的含量Fig.1 Changes of large mineral elements in leaves of red raspberry with different degrees of premature senescence in the same period

2.1.2 紅樹莓不同早衰程度葉片中微量礦質(zhì)元素含量

在同一時(shí)期，紅樹莓不同早衰程度葉片中微量礦質(zhì)元素含量如圖2所示。由圖2可見，鐵是紅樹莓葉片中含量最高的微量元素，樹體上、下部葉片中鐵元素含量變化范圍分別是0.23 ～0.40 和0.25 ～0.42 μg/g，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期，鐵含量呈直線上升趨勢(shì)。樹體上、下部葉片中銅元素含量變化范圍分別是0.016 ～0.019 和0.013 ～0.016 mg/g，呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，在盛花期的早衰葉片中含量降到最低水平0.016 和0.013 mg/g，在果實(shí)成熟初期之后表現(xiàn)穩(wěn)定。錳、鋅元素含量變化趨勢(shì)基本相同，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期均呈現(xiàn)先下降、后升高、再下降的趨勢(shì)，樹體上、下部葉片錳含量變化范圍分別是0.025 ～0.044 和0.025 ～0.048 mg/g，上、下部葉片鋅含量變化范圍分別是0.032 ～0.048 和0.026 ～0.039 mg/g，正常葉片錳、鋅含量顯著低于早衰葉片（P＜0.05）。

圖2 紅樹莓不同早衰程度葉片中微量礦質(zhì)元素的含量Fig.2 Changes of trace mineral elements in leaves of red raspberry with different degrees of premature senescence in the same period

2.2 紅樹莓不同早衰程度葉片中抗氧化酶活性和MDA 含量

在同一時(shí)期，紅樹莓不同早衰程度葉片中抗氧化酶活性和丙二醛含量如圖3所示。由圖3可見，不同發(fā)育階段紅樹莓樹體上、下部葉片SOD活性變化較大，呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì)。在果實(shí)成熟初期，樹體上、下部葉片SOD 活性均為最高，分別為1.75 和0.50 U/(g·min)；在初花期，樹體上、下部葉片SOD 活性均為最低，分別為0.12 和0.29 U/(g·min)。不同發(fā)育階段樹體上、下部葉片POD 活性呈先下降、后上升的趨勢(shì)，在盛花期POD 活性均為最低，分別為8.87 和15.01 U/(g·min)，在果實(shí)成熟初期，樹體上部葉片POD 活性最高，為29.48 U/(g·min)。不同發(fā)育階段樹體上、下部葉片CAT 活性呈下降趨勢(shì)，在果實(shí)成熟盛期，CAT 活性最低，分別為4.43 和17.03 U/(g·min)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，CAT 活性最高，分別為61.83 和31.99 U/(g·min)。不同發(fā)育階段樹體上、下部葉片MDA 含量均呈先上升、后下降的趨勢(shì)，在果實(shí)成熟初期，樹體上、下部葉片MDA含量最低，分別為5.24 和3.64 μmol/g。

2.3 紅樹莓早衰葉片中礦質(zhì)元素含量與抗氧化酶活性及丙二醛含量的關(guān)系

在同一時(shí)期，紅樹莓早衰葉片礦質(zhì)元素含量與抗氧化酶活性及丙二醛含量的相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可知，在78 對(duì)指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系中有35對(duì)達(dá)到顯著相關(guān)，其中呈極顯著正相關(guān)的有N 含量與Mg 含量，Ca 含量與Mg 含量、Fe 含量、Mn含量、Zn 含量、POD 活性，Mg 含量與Fe 含量、Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，F(xiàn)e 含量與Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Mn 含量與Zn 含量、POD 活性，Cu 含量與SOD 活性、CAT 活性，Zn含量與POD 活性，SOD 活性與CAT 活性。達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)的有Ca 含量、Mg 含量、Fe 含量與CAT 活性。這說明在同一時(shí)期紅樹莓葉片不同早衰程度葉片N 含量與Mg 含量，Ca 含量與Mg 含量、Fe 含量、Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Mg含量與Fe 含量、Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，F(xiàn)e 含量與Mn 含量、Zn 含量、POD 活性，Mn 含量與Zn 含量、POD 活性，Cu 含量與SOD 活性、CAT 活性，Zn 含量與POD 活性，SOD 活性與CAT 活性存在著協(xié)同作用，而Ca 含量、Mg 含量、Fe 含量與CAT 活性存在著拮抗作用。

圖3 紅樹莓不同早衰程度葉片中抗氧化酶活性和丙二醛含量Fig.3 Changes of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content in leaves of red raspberries with different degrees of premature senescence in the same period

表1 紅樹莓早衰葉片礦質(zhì)元素含量與抗氧化酶活性及MDA 含量的相關(guān)系數(shù)?Table1 Correlation coefficient of leaf mineral elements with antioxidant enzyme activity and MDA content

3 結(jié)論與討論

葉片作為植物最重要的光合器官，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供光合同化產(chǎn)物與能量物質(zhì)[28]。植物葉片衰老是葉片發(fā)育的最終階段，葉片衰老的精準(zhǔn)調(diào)控對(duì)提高植物產(chǎn)量具有積極意義[29]，葉片衰老受外界環(huán)境諸多因素的影響[30]。葉片的營(yíng)養(yǎng)狀況與衰老密切相關(guān)，研究葉片礦質(zhì)元素含量的變化規(guī)律是進(jìn)行葉片診斷并確定營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充方案的重要依據(jù)[31]。郭向華等[32]通過對(duì)核桃的研究發(fā)現(xiàn)，引起葉片早衰的不是單一因素，而是多種礦質(zhì)元素綜合作用的結(jié)果。本研究結(jié)果表明，在同一時(shí)期不同早衰程度紅樹莓葉片中，礦質(zhì)元素含量變化明顯，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期，正常葉片和早衰葉片中N、P、K、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn 含量差異顯著，其中正常葉片N、K、Cu含量顯著高于早衰葉片，在果實(shí)成熟盛期早衰葉片中P 含量維持穩(wěn)定，這與滕康利等[33]對(duì)核桃樹的研究結(jié)果一致，正常葉片Ca、Mg、Fe、Mn、Zn 含量顯著低于早衰葉片。林添資等[34]通過對(duì)水稻的研究發(fā)現(xiàn)葉片早衰表型發(fā)生在葉齡較早的植株上。本研究結(jié)果表明，葉片中N、P、K 等元素的含量在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期后下降明顯，此時(shí)紅樹莓正處于快速生長(zhǎng)期，要消耗大量養(yǎng)分，因此，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期后是紅樹莓施肥的關(guān)鍵時(shí)期，主要應(yīng)施N、P、K 肥，這與楊艷等[35]對(duì)楊樹的研究結(jié)果一致。張立新等[36]、張生杰等[37]經(jīng)研究認(rèn)為，適量的氮素供應(yīng)能提高葉片保護(hù)酶活性，從而減緩植物的衰老進(jìn)程。N、P、K 元素是影響植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子[38]，同時(shí)，葉片中N、K 含量與葉片早衰程度呈極顯著負(fù)相關(guān)，對(duì)早衰發(fā)生有至關(guān)重要的影響。劉凱等[39]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，施加Mg 肥能明顯增加油桐幼苗相對(duì)葉綠素含量，使其生長(zhǎng)加快。在本研究中，Ca、Mg、Fe 等元素的含量在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期后明顯上升，此時(shí)紅樹莓開始出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。

對(duì)抗氧化酶活性及丙二醛含量的研究結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期至果實(shí)成熟盛期，葉片中CAT 活性呈下降趨勢(shì)，正常葉片CAT 活性顯著高于早衰葉片，因?yàn)镃AT 保護(hù)酶活性降低，不利于清除植物體內(nèi)因受外界損傷而產(chǎn)生的活性氧，從而使葉片發(fā)生早衰，這與劉霞等[40]的研究結(jié)果一致。葉片中POD 活性和MDA 含量呈先下降、后上升的趨勢(shì)，整體來看，正常葉片POD 活性和MDA 含量均低于早衰葉片。果實(shí)成熟初期，上、下部葉片SOD 活性均為最大值，此時(shí)果實(shí)開始成熟，SOD 活性達(dá)到最大，這與楊淑慎等[41]的研究結(jié)果一致。葉片中抗氧化酶活性與礦質(zhì)元素含量有著密切的聯(lián)系[42]。在葉片礦質(zhì)元素含量與抗氧化酶活性及丙二醛含量的相關(guān)性分析中可以發(fā)現(xiàn)，Ca、Mg、Fe 含量與SOD 活性、MDA 含量無相關(guān)性，Ca、Mg、Fe 含量與POD 活性存在協(xié)同作用，Ca、Mg、Fe 含量與CAT 活性均存在拮抗作用。早衰葉片中CAT 活性降低，POD 活性升高，Ca、Mg 和Fe 含量均上升。因此，為降低葉片發(fā)生早衰現(xiàn)象，應(yīng)減少Ca、Mg、Fe 肥的施用。

本試驗(yàn)結(jié)果是在一定的栽培管理?xiàng)l件下得出的，紅樹莓在我國(guó)栽培范圍廣泛，地理環(huán)境、土壤肥力有明顯差異，不同品種或栽培方式的紅樹莓發(fā)生早衰現(xiàn)象的原因也有所不同，此外，紅樹莓的栽培管理，還應(yīng)充分考慮自然條件、品種特性、樹體情況、水肥狀況等因素的影響[43-45]。因此，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，為解決紅樹莓早衰現(xiàn)象，還應(yīng)在此試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂?、人為管理等條件進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。