基于SSR分子標記的枸杞遺傳多樣性研究

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（1.南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；2.青海省海西蒙古族藏族自治州農業(yè)科學研究所，青海 海西 817000）

枸杞Lycium barbarumL.是茄科Solanaceae 枸杞屬LyciumL.多年生落葉灌木，主要分布在青海、新疆、寧夏、甘肅等省區(qū)[1]。枸杞十分抗旱、耐鹽，多生長在鹽堿地和荒漠中，對惡劣的條件有很強的適應性[2]。枸杞果實含有大量的花青素[3-4]、多糖[5-7]、酚酸[8-9]等次生代謝物質，具有較高的藥用價值，長期食用能預防多種疾病，所以目前有關枸杞果實次生代謝物的研究報道較多。然而，在長期的人工選育過程中，枸杞的基因型高度雜合，遺傳背景變得十分復雜[10]，因此，許多研究學者開始從分子生物學的角度對枸杞種質資源的遺傳多樣性展開研究。近年來，國內外的研究者利用DNA 分子標記技術（如ISSR[11-12]、SCoT[13]、AFLP[14-15]、RAPD[16]、SSR[17-19]、SRAP[20]等）對枸杞種質資源的遺傳多樣性進行了研究。

SSR 標記是依據生物基因組中1 ～6 個核苷酸串聯重復的DNA 序列特性開發(fā)的一種分子標記技術，具有多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點，被廣泛應用于遺傳圖譜構建、種質資源鑒定和遺傳多樣性分析等[21-26]方面。但是，由于缺乏基因組信息，基于基因組測序開發(fā)SSR標記的傳統(tǒng)方法成本高，步驟復雜[27]，SSR 在枸杞種質資源的研究中受到極大的限制。近年來，通過轉錄組數據開發(fā)多態(tài)性SSR 分子標記的植物研究有許多報道：姚俊修等[28]利用西洋接骨木的轉錄組數據開發(fā)了25 對具有多態(tài)性的熒光SSR 分子標記，并對8 個不同種的接骨木進行了遺傳多樣性分析；黃海燕等[29]通過分析杜仲轉錄組數據開發(fā)了20 對具有高多態(tài)性的EST-SSR 引物，其研究結果表明，利用以植物轉錄組數據開發(fā)的相關SSR 引物進行植物遺傳多樣性研究是可行的；Chen 等[30]分析了黑果枸杞轉錄組信息并進行了SSR 分子標記的開發(fā)，還利用所開發(fā)的SSR 標記將9 個不同群體的野生黑果枸杞分為3 組；尹躍等[31]利用黑果枸杞轉錄組信息開發(fā)了28 對高多態(tài)性引物，并對24 份枸杞的種質進行了區(qū)分，其研究結果表明，黑果枸杞轉錄組信息可以作為開發(fā)SSR標記的有效來源信息。

目前，有關不同地域黑果枸杞遺傳多樣性的研究報道較少。因此，本研究以美國生物技術信息中心（NCBI）公布的黑果枸杞果實轉錄組數據為基礎，挖掘轉錄因子SSR 引物，分析不同地理種源的黑果枸杞和不同栽培種的紅果枸杞的遺傳多樣性，在分子水平上為黑果枸杞新品種的鑒定和保護提供準確、客觀和公正的判定條件，同時印證了以轉錄組數據開發(fā)黑果枸杞SSR 標記的可行性，以期為黑果枸杞的種質資源開發(fā)和遺傳多樣性分析提供有意義的參考標記。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的30 份枸杞材料由兩部分構成：一部分為青海省海西蒙古族藏族自治州農業(yè)科學研究所枸杞院士工作站枸杞種質資源圃中保存的25 份枸杞材料，其中5 份為黑果枸杞，1 份為黃果枸杞，19份為紅果枸杞；另一部分為2018年7月在新疆維吾爾自治區(qū)和甘肅省等省區(qū)野外采集的5 份野生黑果枸杞。供試的30 份枸杞材料的基本情況見表1。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 的提取

利用Magen 植物組織DNA 提取試劑盒提取枸杞葉片總DNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度，用Nanodrop 核酸蛋白分析儀檢測其濃度，然后將其稀釋為50 ng·μL-1并保存于-20 ℃的冰箱中以備用。

1.2.2 轉錄組數據處理及引物設計

從NCBI的GenBank 數據庫中下載黑果枸杞轉錄組數據，登錄號為SRR2344923。將下載到的轉錄組數據通過Trinity 組裝軟件進行序列組裝，然后利用MicroSAtellite（MISA http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）工具搜索Unigene 序列的SSR位點，參照尹躍等人[31]所用的方法和標準進行搜索。采用Primer Premier 3.0 軟件對含有SSR 位點的序列設計引物[28]，引物設計參數為：引物長度為18 ～27 bp，GC 為40%～60%，退火溫度為50 ～60 ℃，PCR 擴增長度為100 ～300 bp，其他參數均設為默認值。

表1 30 份枸杞材料的基本信息Table1 The information of 30 L.barbarum

1.2.3 引物的篩選

引物由南京擎科生物技術公司合成，PCR反應所需的2×Taq PCR MasterMix 及DNA marker均購買于擎科生物（南京）有限公司。從供試材料中選取植物表型性狀差異較大的6 份樣品的DNA 模板對116 對引物進行篩選，最終選擇條帶清晰、穩(wěn)定性和多態(tài)性均好且對6 份樣品均有較好鑒別力的20 對引物用于所有樣品的PCR 擴增，20 對引物的序列信息見表2。

1.2.4 SSR-PCR 反應體系

采用15 μL 的PCR 擴增反應體系：DNA 模板1 μL (50 ng·L-1)，2×Taq PCR Master Mix（含有Taq 酶、dNTP 和緩沖液）8 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol·L-1），去離子水15 μL。PCR 擴增反應程序為：94 ℃，預變性4 min；94 ℃，變性30 s；退火溫度56 ～60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后，72 ℃，延伸10 min，于4 ℃條件下保存。

1.2.5 PCR 產物的檢測

先用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物有無特異性位點，對有特異性位點的樣品，再用非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳后用熒光染料染色，用生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行觀察、拍照。

表2 SSR 引物序列信息Table2 The information of SSR primer sequences used in this study

1.3 數據處理

采用Excel 軟件統(tǒng)計電泳圖中的譜帶，按照擴增條帶分子量的大小在相同遷移位置讀取，有條帶的記為1，無條帶的或無法辨別的帶型記為0，構建“0,1”矩陣。利用Popgene 32 軟件計算Nei’s的遺傳多樣性指數（H）、Shannon 信息指數（I）、擴增總條帶數和多態(tài)性位點百分率（PPL）等遺傳參數[32]，使用PIC_calc 0.6 軟件計算各引物位點的多態(tài)信息含量（PIC）。利用NTSYS-pc 軟件計算品種間遺傳相似系數（GS），并按UPGMA 方法進行聚類分析[13]，采用GraphPad Prism 8 軟件優(yōu)化遺傳相似系數矩陣，構建30 個枸杞品種的聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SSR 引物擴增結果分析

擴增統(tǒng)計結果見表3。表3表明：用篩選出的20 對SSR 引物分別對30 個枸杞品種進行SSRPCR 擴增，從20 對SSR 引物中共擴增出121 條條帶，平均每個引物擴增6.05 條，擴增出的條帶數大多為2 ～8 條。不同引物擴增出的多態(tài)性條帶數量差異較大，其中擴增條帶最多的引物為P1-5，其條帶為16 條，擴增條帶最少的引物為P3-26，其條帶為2條。引物P1-5的部分擴增結果如圖1所示。30 份枸杞材料的有效等位基因數（Ne）的變化范圍為1.201 6 ～1.682 8 個，其均值為1.473 1 個；Nei’s 多樣性指數（H）的變化范圍為0.150 3 ～0.391 5，平均值為0.291 7；Shannon 信息指數（I）的變化范圍為0.265 4 ～0.576 5，平均值為0.451 7；多態(tài)信息量（PIC）范圍為0.325 ～0.898，平均值為0.667。一般認為，當PIC ＜0.25 時，該引物為低度多態(tài)性信息引物；當PIC ＞0.50 時，該引物則為高度多態(tài)性信息引物[33]。因此，所選引物大部分為高度多態(tài)性信息引物，說明這些引物均可用于枸杞種質資源的鑒定和研究。

2.2 遺傳相似性與聚類分析

采用Excel 軟件將30 份枸杞樣品與122 個位點統(tǒng)計為原始矩陣，再以NTSYS-pc 2.1 軟件計算30 份枸杞材料間的遺傳相似系數（GS），計算結果如圖2所示。由圖2可知，任意兩份材料之間的相似系數為0.459 2 ～0.991 8，其平均GS 值為0.725 5。

基于30 份枸杞材料的遺傳相似系數，用UPGMA 法對其進行聚類分析，結果如圖3所示。由圖3可知，在遺傳相似系數0.62 處，30 份枸杞材料可聚為如下6 個組。第I組包括10 份黑果枸杞，青海（H1、H2、H3、H4、H5、H6）、新疆（H7、H8、H9）、甘肅（H10）的黑果枸杞聚為一類，青海和新疆的黑果枸杞的遺傳距離較近，而與甘肅黑果枸杞的遺傳距離較遠。第Ⅱ組有紫果枸杞（R13）、黃果枸杞（R14）和水果枸杞（R15）共3 份材料；紫果枸杞可能由于在培育雜交新品種研究中以黑果枸杞為親本，導致其基因和本身性狀都趨近于黑果枸杞；黃果枸杞與水果枸杞聚為一類，說明青海當地栽培的水果枸杞與黃果枸杞的親緣關系較近，這與其研究所用親本的遺傳關系相近有關。第Ⅲ組包括抗旱優(yōu)良品種與花用枸杞和多果類枸杞。第Ⅳ組所聚品種數最多，占試驗材料的36.7%；其中，柴杞1號（R2）和柴杞3號（R3）、柴杞2號（R4）和高產抗病型（R6）、茶用枸杞（R9）和R12 之間均表現出非常近的親緣關系，它們均來自于青海省德令哈市尕海鎮(zhèn)的枸杞良種繁育基地，其親本來源種質成分可能有一定的相似性；被聚在一類的R11、R18、R19 均為新培育的植株材料，說明它們具有相似的遺傳背景。第Ⅴ組包括菜用枸杞（R1）與葉用枸杞（R8）。第Ⅵ組為發(fā)現于青海省德令哈市尕海鎮(zhèn)的野生紅枸杞。第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組內的栽培枸杞的遺傳相似系數均較高，說明其遺傳距離越近，親緣關系也就越近。這可能由于枸杞種質資源比較豐富且栽培歷史悠久，屬內種間（滲透）雜交現象普遍，加之地方品種本身無科學命名，導致品種資源類型多且名稱混亂[34]。

表3 供試枸杞材料遺傳多樣性的擴增統(tǒng)計結果Table3 The statistics of genetic diversity of L.barbarum

圖1 引物P1-5 對30 份枸杞材料的部分擴增結果Fig.1 Amplified 30 samples results partly by primers P1-5

圖2 供試的30 份枸杞材料的遺傳相似系數Fig.2 Genetic similarity coefficient of 30 samples of L.barbarum

圖3 供試的30 份枸杞材料的聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis results of 30 samples of L.barbarum

3 結論與討論

分子標記技術被廣泛應用于各類物種遺傳資源的研究中，關于利用不同分子標記技術對枸杞的遺傳多樣性與親緣關系的研究報道較多[11,13,16-17,20]。本研究利用黑果枸杞轉錄組數據開發(fā)出枸杞SSR引物，對10 份不同地域的黑果枸杞及20 份不同栽培型的紅果枸杞進行了分子標記分析。從182對引物中共篩選出20 對多態(tài)性SSR 引物。對青海、新疆、甘肅這3 個省區(qū)的10 份黑果枸杞、20 份栽培紅枸杞品種進行了遺傳多樣性分析，計算出了不同材料間的遺傳距離，明確了30 份材料間親緣關系的遠近，研究結果表明，基于黑果枸杞轉錄組數據開發(fā)的引物可以用于枸杞品種的鑒別，20 對引物的多態(tài)性信息量豐富，平均為0.667，這一結果稍低于尹躍等[31]的研究結果；其次，將10 份黑果枸杞再作聚類分析，青海、新疆、甘肅的黑果枸杞被區(qū)分開來，這一結果與Chen 等[30]的研究結果一致，說明以黑果枸杞轉錄組數據開發(fā)的SSR 分子標記可以從分子水平上鑒別黑果枸杞品種的差異；尤其是H1 和H2、H4 和H6 之間的遺傳相似系數均高達0.991，這充分說明了基于黑果枸杞的轉錄組數據開發(fā)的SSR 引物能有效地鑒別黑果枸杞的品種差異。此結果也印證了Ono等[35]的“用石榴皮轉錄組信息開發(fā)了SSR 分子標記，并且可以有效地對石榴品種進行鑒別，說明了從轉錄組數據中開發(fā)SSR 分子標記的可靠性”這一研究結果。本研究篩選出的20 對SSR 引物，可以用于黑果枸杞品種鑒定和黑果枸杞分子輔助遺傳育種等方面的研究之中。

本研究所用材料主要來源于青海省德令哈市尕海鎮(zhèn)枸杞良種繁育基地，但是，研究中出現了聚類分析結果與品種來源信息不相符的情況，如黃果枸杞、水果枸杞與黑果枸杞的遺傳距離相對較近，但其性狀卻存在很大的不同，其原因可能是，所用引物數量有限，擴增的多態(tài)性條帶較少，不能充分表現材料本身的特異性，因此需要進一步開發(fā)黑果枸杞的SSR 引物。傳統(tǒng)SSR 分子標記的開發(fā)所需費用高，而通過轉錄組數據開發(fā)SSR 引物，不僅可以開發(fā)出針對表型的特異性SSR 引物，而且所開發(fā)出的引物還具有種屬間良好的通用性，還可省時省力，節(jié)約成本。

本研究基于轉錄組數據開發(fā)并篩選出多態(tài)性較好的20 對SSR 引物，不僅可應用于分析現有枸杞屬種質資源的遺傳多樣性，還可以應用于黑果枸杞種質的遺傳多樣性分析。由于目前收集到的黑果枸杞種質資源相對較少，本研究僅對目前青海省德令哈市枸杞良種繁育基地中收集、保存的黑果枸杞進行了評價，所用的引物僅來自于黑果枸杞果實轉錄組數據中的一部分，因此應開發(fā)和挖掘更多的SSR 引物進行綜合深入的評價分析。在今后的黑果枸杞研究工作中，還應收集國外的黑果枸杞種質資源，挖掘國內枸杞屬野生種質資源，進一步豐富黑果枸杞的轉錄組數據；開發(fā)新的SSR 引物，豐富現有引物數據；利用分子輔助育種方法創(chuàng)新研究黑果枸杞種質資源。