內(nèi)置式雙向電極觀察先天性巨結(jié)腸動物模型腸電圖

李霽偉，謝余澄

（昆明市兒童醫(yī)院病理科，云南昆明 650228）

無神經(jīng)節(jié)細胞性巨結(jié)腸?。╤irschsprung’s disease，HD），是一種嚴重危害嬰幼兒健康的先天性消化道畸形[1]。主要病理變化是一段結(jié)腸壁內(nèi)缺乏神經(jīng)節(jié)細胞，從而無法誘導該段結(jié)腸神經(jīng)動作電位無法形成和傳導，致使腸道持續(xù)性痙攣，腸腔狹窄，內(nèi)容物儲留，繼發(fā)性腸炎等一系列嚴重消化道癥狀[2]?；A(chǔ)研究已經(jīng)表明，胃腸道擁有多個起搏點均能自主發(fā)放節(jié)律性慢波，延胃腸道平滑肌向遠端傳播。本研究在改良的HD 動物模型基礎(chǔ)上，采用自主研發(fā)的腸道內(nèi)置式雙向電極，觀測和接收HD 模型乳鼠不同腸道內(nèi)電生理及腸電圖改變，并與組織病理學檢查診斷對比分析，探討內(nèi)置式雙向電極在HD 診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級SD 大鼠60 只，2 月齡，體重（220±10）g，雌雄各半，購自于昆明醫(yī)科大學動物實驗室，并委托飼養(yǎng)至性成熟后繁殖的4～5 日齡乳鼠80 只。

1.1.2 試劑 PHOX2B 兔抗人多克隆抗體ImmunoWay Biotechnology Company。

1.1.3 儀器 電刺激儀（model A310）及電隔離儀（Stimulus Isolator，model A365）美 國 World Precision Instruments，Inc（Sarasota，F(xiàn)lorida）；生物信號采集處理系統(tǒng)（MedLab－U/8c502）中國南京美易科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HD 動物大鼠模型的建立和分組 新生4～5 日齡SD 乳鼠40 只為實驗組，乙醚麻醉，在無菌條件下腹部正中切口提出乙狀結(jié)腸，將0.5%BAC溶液浸泡過濾紙條（1.5 cm×1 cm）緊貼腸壁環(huán)形包繞結(jié)腸1 周，每5 min 滴加50 μL 的0.5%BAC溶液于濾紙上，保持濾紙濕潤。60 min 后移去濾紙條，清潔腹腔，還納腸管，關(guān)閉腹腔，注射用青霉素鈉粉劑涂切口。對照組40 只，手術(shù)方式同實驗組，用生理鹽水代替0.5%BAC 溶液，作用時間及計量同實驗組。術(shù)后第1 周實驗組開始出現(xiàn)腹脹，至術(shù)后第2 周實驗組均出現(xiàn)不同程度的排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，糞便顆粒比對照組干燥且明顯變小，處死后大體解剖可見BAC 處理結(jié)腸段腸管狹窄痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內(nèi)容物潴留。

1.2.2 常規(guī)HE 染色觀察神經(jīng)節(jié)細胞 病理常規(guī)HE 染色操作步驟，HD 模型乳鼠腸道組織標本切片顯色，觀察著色后神經(jīng)節(jié)細胞在腸道的正常段、移行段和狹窄段的分布和數(shù)量。

1.2.3 免疫組織化學PHOX2B 抗體在神經(jīng)節(jié)細胞中的特異表達 S-P 免疫組織化學方法操作步驟，PHOX2B 抗體在HD 模型乳鼠腸道組織標本切片上顯色，觀察PHOX2B 著色后神經(jīng)節(jié)細胞在腸道的正常段、移行段和狹窄段的分布和數(shù)量。

1.2.4 腸道電生理檢測 經(jīng)肛門將三對固定在腸道中空球囊上的環(huán)狀電極放于HD 實驗組病變腸道的正常段、移行段和狹窄段內(nèi)，電極間間距為0.5 cm。而對照組乳鼠，環(huán)狀電極放入直腸內(nèi)距肛門外緣2 cm。通過生物信號采集處理系統(tǒng)（MedLab－U/8c502）分別記錄正常段、移行段和狹窄段腸道傳導電信號。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 軟件對收集的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。定量資料服從正態(tài)分布的用（）描述，不服從正態(tài)分布的用P50（P25，P75）描述，進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，滿足正態(tài)性及方差齊性的多組間比較采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)性或方差齊性的定量資料，組間比較采用Kruskal Wallis H 檢驗。如果多組建比較有差異，采用Bonferroni 法進行兩兩比較。兩個定量變量的相關(guān)性分析，對不符合正態(tài)分布的定量資料，采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)（rs）。檢驗水準為雙側(cè)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。組間兩兩比較檢驗水準調(diào)整為雙側(cè)α=0.0167，即P＜0.0167 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HD 幼鼠模型鑒定

分別取對照組乙狀結(jié)腸正常段，實驗組乙狀結(jié)腸狹窄段和移行段，做病理常規(guī)HE 染色，觀察腸壁肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)（圖1A-C），計數(shù)正常段、移行段和狹窄段神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量（表1），其中正常段與移行段的細胞數(shù)量不服從正態(tài)分布，分別為5（4，6），1（1，2），正常段細胞數(shù)量多于移行段（H=39.70，P＜0.001）與狹窄段（H=79.85，P＜0.001），移行段細胞數(shù)量多于狹窄段（H=40.15，P＜0.001），證實成功構(gòu)建HD 乳鼠實驗動物模型。

圖1 不同階段腸道神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)（HE×400）Fig.1 Morphology of intestinal ganglion cells in different segments（HE×400）

表1 HE 染色肌間神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量[P50（P25，P75）]Tab.1 The number of intramuscular ganglion cells stained by HE[P50 （P25，P75）]

2.2 PHOX2B 抗體特異性表達

顯微鏡下觀察PHOX2B 抗體著色于神經(jīng)節(jié)細胞的胞漿與胞核（圖2，A-C），計數(shù)正常段、移行段和狹窄段神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量（表2），分別為5.20±0.88，2.03±0.73，0，正常段細胞數(shù)量多于移行段（H=40.00，P＜0.001）與狹窄段（H=80.00，P＜0.001），移行段細胞數(shù)量多于狹窄段（H=40.00，P＜0.001），證實成功構(gòu)建HD 乳鼠實驗動物模型，并且PHOX2B 抗體著色下神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量與HE 染色觀察數(shù)量相符。

2.3 不同階段腸道電生理測定

經(jīng)腸道內(nèi)置雙向電極引導和MEDLAB 生物信號采集系統(tǒng)顯示正常段、移行段和狹窄段腸道腸電圖電信號（圖3，A-C），記錄各段生物電信號強弱（表3），分別為76.94±9.06，15.40±5.03，2.5（1.8，3.7），正常段腸道電壓高于移行段（H=41.08，P＜0.001）與狹窄段（H=78.93，P＜0.001），移行段腸道電壓高于狹窄段（H=37.85，P＜0.001）。

圖3 不同節(jié)段腸道的腸電圖形態(tài)和強度Fig.3 Morphology and intensity of electroenterogram in different segments of intestinal tract

表3 腸電圖不同節(jié)段電壓[（）或P50（P25，P75）]Tab.3 The voltage of different segments in electrointestinogram[（）或P50（P25，P75）]

表3 腸電圖不同節(jié)段電壓[（）或P50（P25，P75）]Tab.3 The voltage of different segments in electrointestinogram[（）或P50（P25，P75）]

與狹窄段腸管比較，△P＜0.001；與移行段腸管比較，▲P ＜0.001。

2.4 神經(jīng)節(jié)數(shù)量與電壓幅度相關(guān)性分析

不論HE 染色，還是PHOX2B 染色觀察下，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量與腸道電壓強度存在正相關(guān)，即細胞數(shù)量越多，接收電壓越大（rs=0.903，P＜0.001；rs=0.907，P＜0.001），見表4。

表4 神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量與接收電壓的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of ganglion cell number and intestinal voltage

3 討論

HD 作為嬰幼兒先天性消化道畸形之一，其發(fā)病率在1:2 000～5 000，我國約為1:2 500，平均男與女之比為4:1，新生兒發(fā)病率逐年攀升[3]。多年來對HD 的診斷完全依賴于常規(guī)病理，盡管診斷方式不斷更新，從最初的常規(guī)HE、免疫組織化學染色、冰凍到乙酰膽堿酯酶觀測，再到基因?qū)W篩查，然而對HD 的誤診率依然較高[4-6]。此外，還缺乏動態(tài)的、連續(xù)性的、廣泛及直觀的對HD 和腸道神經(jīng)節(jié)細胞的有效監(jiān)測手段。

胃腸道電生理學的發(fā)展，為研究和探索消化道機能開辟了一條新的途徑。早在1922 年，Alvarez首次報道從人體表記錄到胃電活動[7]。1957 年，Davis 等敘述了經(jīng)皮膚電極從腹部記錄胃電活動的技術(shù)，并且深入探討了呼吸、運動偽跡、心電等信號對胃電的干擾，以及食物、休息、視覺刺激等因素對胃電圖的影響[8-9]。此后，于1959 年Tiemann F和 Reichertz P[10]正式提出“ 胃電圖 "（electrogastrogram，EGG）以及腸電圖（electrointestinogram，EIG）的名稱。1983 年，美國心理生理學會以“胃電圖及其意義”為專題，編輯出版了名為《胃電圖及其臨床應用》的專著[11]，系統(tǒng)性的介紹了胃電圖的原理、方法、發(fā)展歷史和新近的研究成果。1993 年，國際胃電圖學術(shù)會議在波士頓舉行，主旨介紹了胃電圖信號的獲取和分析、數(shù)學模型及儀器的微型化[12]。1999 年廈門的胃電圖學術(shù)會議制定了我國的胃電圖診斷標準（草案）[13]，目前對于胃電圖的檢測及研究工作不斷發(fā)展，動態(tài)胃電圖儀的推出也使得這一檢測方法日趨成熟[14]。然而，國內(nèi)外對兒童消化道運動與胃腸電圖的關(guān)系、節(jié)律紊亂等研究較少，進展緩慢，其中專門針對HD 的研究和動物模型建立更為少見[15-17]。

回顧過去研究，兒童消化道疾病問題是基于成人胃腸電圖研究的總結(jié)，依然停留在體表引導電信號而非直接體內(nèi)引導及動態(tài)觀察，也并沒有從病理診斷HD 標準角度來考慮病因與腸電圖之間的關(guān)系。因此，基于消化道解剖結(jié)構(gòu)開放性的特點，筆者改良并建立了HD 乳鼠實驗動物模型，并采用腸道內(nèi)置式雙向電極觀察，發(fā)現(xiàn)正常段、移行段和狹窄段腸壁引導出的腸電圖電信號強度有差異，特別是正常段與狹窄段差異顯著（P＜0.001）。同時，HD 模型組幼鼠伴發(fā)有排便次數(shù)減少、便細、腹脹等一系列臨床癥狀。而經(jīng)HE 和PHOX2B 抗體染色證實，移行段內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少，細胞發(fā)育幼稚，胞漿稀少，核仁不明顯，特別是狹窄段內(nèi)神經(jīng)節(jié)細胞消失，僅見增生粗大的神經(jīng)叢。腸電圖電信號強弱與神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量、形態(tài)及分布呈正相關(guān)（P＜0.05），即神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量越少，電壓強度越小；反之，電壓強度越大，神經(jīng)節(jié)數(shù)量越接近正常腸道。特別重要的是狹窄段電信號極弱，無法形成能有效觀察的腸電圖，這一特點將是筆者研究腸電圖信號為診斷HD 提供的重要參考依據(jù)。此外，內(nèi)置式設(shè)計能較為持續(xù)和動態(tài)的觀察到了腸道內(nèi)的變化，在免除有創(chuàng)性標本采樣的同時，降低了手術(shù)風險和術(shù)后并發(fā)癥，大幅度提高了幼鼠生存率。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)之上證實了神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量與電信號強弱的相關(guān)性，希望為臨床提供一種行之有效的、無創(chuàng)性的診斷HD 途徑。而本實驗還存在有異位電信號干擾，選擇更為合理的動物建立模型及HD 病因機制不清等諸多不足，待進一步深入研究。