HPLC 法同時測定魚腥草中4 種黃酮苷的含量*

廖衛(wèi)波 王亞敏 戴迪 虞金寶 李晶

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜（Houttuynia Cordata Thunb）的全草。在我國分布廣泛，中部、東南至西南部等地區(qū)均較為常見，常生于路旁、溝邊、溪邊及林下濕地，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋之功效，應(yīng)用廣泛，并且在我國西南地區(qū)人們多有種植并將其嫩根莖作為蔬菜或調(diào)味品，是一種重要的收入藥食同源全目錄名單的植物資源[1]。學(xué)者對魚腥草含量測定及藥理方面亦有諸多研究[2～4]，現(xiàn)代藥理研究表明魚腥草具有抗腫瘤、增強機體免疫力和抗氧化等作用，有效物質(zhì)為黃酮類成分[5～7]。國內(nèi)外對于魚腥草中揮發(fā)油成分的研究較多，但以黃酮類為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)產(chǎn)品專利較為少見，并且在《中國藥典》2015 年版中也未明確相關(guān)黃酮類藥效成分的含量測定指標(biāo)。本研究采用高效液相色譜法（HPLC），建立了同時測定魚腥草中4 種黃酮苷（蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷）含量的測定方法，以期為魚腥草藥材中黃酮苷類成分的含量測定及質(zhì)量控制提供一定的參考?，F(xiàn)報道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD 高效液相色譜儀（LC-20AD 泵、SIL-10ADVP 控制器、SPD-20A 紫外檢測器、CTO-10ASVP 柱溫箱，購于日本島津公司）；ml-T 型萬分之一分析天平、XPR 型十萬分之一分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 魚腥草藥材購于樟樹市中藥材市場；蕓香苷（批號：100080-201610）、金絲桃苷（批號：111521-201708）、槲皮苷（批號：111538-201606）、異槲皮苷（批號：111809-201403），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜級）；甲醇（分析純）；磷酸（分析純）；娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：迪馬DiamonsilTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（H3PO4）水溶液（B），按表 1 進行梯度洗脫；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫條件

2.2 供試品溶液的制備 稱取魚腥草藥材粉末（過60 目篩）2 g，精密稱定，置于 100 ml 錐形瓶中，加入90%甲醇溶液90 ml，記錄所稱定重量，浸漬過夜（8 h）后以超聲儀超聲提取，超聲功率為100 w，頻率為40 kHz，超聲提取時間1 h，冷卻后用90%的甲醇溶液補足失重，過濾，續(xù)濾液用孔徑0.22 μm 的微孔濾膜過濾，備用。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 對照品母液的制備 分別精密稱取蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷4 種對照品10.52 mg、10.33 mg、8.79 mg 和 9.52 mg，分別置于 10 ml容量瓶中，分別加90%甲醇溶液使溶解并定容至刻度，即配制成濃度為 1.052 mg/ml、1.033 mg/ml、0.879 mg/ml 和0.952 mg/ml 的對照品母液，備用。

2.3.2 混合對照品的制備 分別精密吸取蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷4 種對照品母液0.2 ml、0.6 ml、0.4 ml 和 1.0 ml 同時置于 10 ml 容量瓶中，加入90%的甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即配制成 濃 度 分 別 為 21.04 μg/ml、61.98 μg/ml、35.16 μg/ml 和95.20 μg/ml 的混合對照品溶液，以孔徑0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.4 分離度 精密吸取混合對照品、魚腥草供試品溶液適量，按“2.1”色譜條件下進樣測定分析，由圖可見，各成分與相鄰色譜峰均能達到有效分離，目標(biāo)峰分離度均＞1.5 且各峰理論塔板數(shù)均＞3 500。見圖1。

圖1 混合對照品（A）及魚腥草供試品（B）HPLC 色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 吸取“2.3.2”所制混合對照品溶液，按“2.1”色譜條件分別進樣，進樣量分別為2 μl、5 μl、8 μl、10 μl、12 μl、15 μl、20 μl，以樣品質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)分別計算及繪制蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷4 種黃酮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相應(yīng)的線性范圍，結(jié)果顯示，蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的相關(guān)系數(shù)r 分別為 0.999 8、0.999 7、0.999 8 和 0.999 6，表明 4 種黃酮苷在各自相應(yīng)線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見表2。

表2 4 種黃酮苷成分線性范圍

2.6 精密度試驗 吸取“2.3.2”所制混合對照品溶液，以孔徑 0.22 μm 微孔濾膜濾過，按“2.1”色譜條件連續(xù)進樣6 次，進樣量為10 μl，分別記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷相應(yīng)峰面積并計算相應(yīng)的 RSD 值，RSD 值依次為 0.34%、0.30%、0.83%及0.52%，均＜2.00%，試驗表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫條件下放置，并分別于 0、2、4、8、12、16、24 h 按“2.1”色譜條件進樣，進樣量為10 μl，記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷各色譜峰的峰面積，并計算4 種黃酮苷24 h 內(nèi)各自相應(yīng)峰面積的RSD 值，RSD 值依次為0.73%、0.42%、0.75%和0.68%（均＜2.00%），表明魚腥草供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批次的魚腥草粉末6 份，按“2.2”方法制備魚腥草供試品溶液，并按“2.1”色譜條件方法對其進行測定分析，進樣量為10 μl，記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷各色譜峰的峰面積，并計算4 種黃酮苷各自相應(yīng)含量的RSD 值，RSD 值依次為0.96%、1.05%、0.87%和 1.12%（均＜2.00%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗 取同一批次魚腥草粉末9 份（約1 g），精密稱定，加入低、中、高三個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，每個濃度三份，按“2.2”方法制備成供試品溶液，并按“2.1”色譜條件方法對其進行測定分析，進樣量為10 μl，記錄各色譜峰峰面積，計算回收率。結(jié)果顯示，蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷加樣回收率在95.16%～102.14%范圍內(nèi)，RSD值均＜2.00%，表明該方法良好，準(zhǔn)確度符合要求。見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品含量測定 取不同批次魚腥草粉末各2 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件方法測定分析，進樣量為10 μl，記錄蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的色譜峰面積，計算4 種黃酮苷各自相應(yīng)的含量。結(jié)果顯示，三批樣品中4 種黃酮苷蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的含量存在一定的差異，蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的平均含量分別為0.70 mg/g、2.97 mg/g、0.68 mg/g 和 4.44 mg/g，總含量約占8.80 mg/g。金絲桃苷和槲皮苷的含量較高，僅二者即占總含量的7.41 mg/g。見表4。

表4 樣品含量測定

3 討論

魚腥草作為重要的藥食同源植物，其藥用價值應(yīng)用廣泛，單一指標(biāo)的質(zhì)量評價對其質(zhì)量控制存在一定的不足，不能很好反映藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。黃酮類成分作為魚腥草有效物質(zhì)，其含量測定尤為重要[8～9]，本研究以HPLC 法建立了同時測定4 種黃酮苷含量的方法，為其質(zhì)量評價提供了一定參考。

魚腥草中蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷4 種成分均屬于黃酮苷類化合物，易溶于水及甲醇等較強極性的溶劑中，本研究前期分別選擇（50%、75%、90%）甲醇、純甲醇、（50%、75%、90%）乙醇及水等多種不同溶劑作為提取溶劑，探究優(yōu)選最佳提取溶劑，結(jié)果表明，以90%的甲醇作為提取溶劑時4種目標(biāo)產(chǎn)物均能達到較完全的提取效果，且雜質(zhì)干擾較少。本研究中針對金絲桃苷與異槲皮苷分離度不佳及峰拖尾等問題，采用梯度洗脫，以乙腈-0.1%H3PO4為流動相，并適當(dāng)延遲出峰時間的方式，最終獲得了較好的分離效果。

此外，本研究的方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該方法操作簡便，具有較高的準(zhǔn)確度，靈敏度及穩(wěn)定性。通過測定魚腥草中蕓香苷、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷4 種黃酮苷成分的含量，能提高魚腥草藥材在質(zhì)量控制方面的準(zhǔn)確性及可控性，對其應(yīng)用及開發(fā)有重要的意義。