擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯虛擬仿真實驗系統(tǒng)建設

霍穎異，王君暉，史 影，王國強，吳 敏

（1.浙江大學 國家級生物實驗教學示范中心，浙江 杭州 310058；2.浙江大學 生命科學學院，浙江 杭州 310058）

“遺傳學及實驗”是生物科學、生態(tài)學、農(nóng)學、生物工程和生物醫(yī)學等生命科學相關專業(yè)的一門重要基礎課程，在培養(yǎng)學生的科學思維、創(chuàng)新精神和實踐能力方面發(fā)揮重要作用，其教學內(nèi)容應側(cè)重應用并緊跟時代發(fā)展和社會需要[1]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種近年來快速發(fā)展的基因編輯技術，已廣泛應用于細菌、真菌、植物和動物的基因編輯[2]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是其中研究最深入、應用最成熟的一類，已成功在多種植物中實現(xiàn)了定點基因組編輯[3]。根據(jù)“雙一流建設”和創(chuàng)新型人才培養(yǎng)需要，浙江大學生命科學學院對“遺傳學”和“遺傳學及實驗”等課程開展了系列改革，積極將科研成果轉(zhuǎn)化為教學案例，更新傳統(tǒng)教學內(nèi)容，增加前沿性和創(chuàng)新性實驗項目，將近年來快速發(fā)展并廣泛應用的CRISPR/Cas9 基因編輯技術引入實驗教學中。

近年來，隨著現(xiàn)代信息技術的快速發(fā)展，虛擬仿真技術已成功應用于高校生物學實驗教學，并且獲得了顯著的教學效果[4-6]。虛擬仿真實驗教學可以突破實體教學局限，拓展實驗教學的廣度和深度，延伸實驗教學時間和空間，有效推進教學改革并提升實驗教學質(zhì)量[7]。為實現(xiàn)基因編輯綜合性實驗體系的教學實踐，依托浙江大學生命科學學院人才培養(yǎng)特色和國家級生物學實驗教學示范中心實驗教學優(yōu)勢，本文構建了擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯虛擬仿真實驗系統(tǒng)，以彌補實體實驗教學的局限，促進學生綜合實驗能力的培養(yǎng)。

1 傳統(tǒng)實驗教學存在問題

擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯相關實驗課程自開設以來，深受學生歡迎，然而因?qū)嶓w實驗開展存在一些困難，目前僅開設了擬南芥基因編輯突變體鑒定的實驗教學特色專題，完整的系統(tǒng)性實驗難以在實體實驗教學中完全實現(xiàn)，主要困難表現(xiàn)為：

（1）實驗整體綜合性強且耗時長，相關教學實踐難以系統(tǒng)性安排完整實驗技術流程，學生缺乏對該綜合性實驗體系的系統(tǒng)性認識和掌握。

（2）實驗技術性強且難度大，如電擊轉(zhuǎn)化和花序轉(zhuǎn)染實驗，學生實驗成功率難以保證，課時所限又難以安排多次重復實驗，影響實際教學質(zhì)量和效果。

（3）實驗時間不固定，擬南芥種植周期長，過程長達2～3 個月，且需在水分、光照、溫度、病蟲害等方面進行養(yǎng)護管理，需占用學生較多課外時間。

（4）實驗時效性強，例如花序轉(zhuǎn)染法對植株生長時期有一定要求，其時效性強增加了實驗教學安排和實驗指導的難度。

2 虛擬仿真實驗內(nèi)容設計和建設

擬南芥IAA2（Indole Acetic Acid 2）基因是轉(zhuǎn)錄抑制蛋白Aux/IAA 家族中的一員[8]。前期科研成果表明，擬南芥野生型和IAA2 突變體在生長素敏感性和根向地性等方面具有明顯的表型差異[9]?；谇捌诳蒲谐晒?，本文設計并構建利用CRISPR/Cas9 技術獲得并鑒定擬南芥IAA2 突變體的綜合性虛擬仿真實驗系統(tǒng)。系統(tǒng)主要包括實驗原理、實驗材料、實驗操作等主要模塊，緊緊圍繞實驗中“做什么、為什么做、怎么做”開展。學生可以隨時通過瀏覽器進入網(wǎng)頁并打開實驗系統(tǒng)，自主學習相關理論知識和實驗過程，而后進行虛擬實驗操作和知識鞏固，學習使用CRISPR/Cas9 技術基因編輯擬南芥，從而掌握利用CRISPR/Cas9 技術獲得并鑒定突變體的方法。

2.1 引導短視頻

虛擬仿真實驗系統(tǒng)以一段“緒論式”短視頻作為引導，視頻簡要介紹CRISPR/Cas 技術的來源、發(fā)展歷程、科學意義和社會意義。“緒論式”短視頻一方面幫助學生認識相關技術的科學性和前沿性以及實驗教學的必要性，激發(fā)學生學習實驗原理和技術的欲望；另一方面，引導學生主動獨立思考和討論相關問題，例如CRISPR/Cas 技術的迅速發(fā)展過程、該技術給科學界帶來的變革、該技術引發(fā)社會廣泛關注的倫理問題等。

2.2 實驗原理

實驗原理包括原核生物CRISPR/Cas9 系統(tǒng)結構和功能、CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基因編輯工作原理、突變體鑒定原理等部分。學生通過圖片和動畫學習實驗涉及的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)組成、原核生物CRISPR/Cas9系統(tǒng)功能、T7 核酸內(nèi)切酶酶切法鑒定突變體原理、PAGE 法鑒定突變體原理等相關知識點；通過三維建模和視頻動畫形象展示難懂的CRISPR/Cas9 基因編輯工作原理（如圖 1 所示），幫助學生深刻地理解利用CRISPR/Cas9 技術開展基因編輯的工作原理。

圖1 三維建模原理動畫

2.3 實驗材料

實驗材料部分包括對模式植物擬南芥、靶點基因和基因編輯載體的介紹。學生通過對實驗材料的學習，掌握擬南芥的遺傳學特點、靶點基因IAA2 的功能、基因編輯載體的結構，深入理解實驗意義、實驗原理、實驗過程和實驗結果。

2.4 實驗操作

實驗操作是虛擬仿真實驗系統(tǒng)的核心模塊，包括擬南芥種植栽培、電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌、花序轉(zhuǎn)染法獲取轉(zhuǎn)基因植株、CTAB 法提取擬南芥基因組、PCR 法擴增靶點基因片段、靶點基因片段變性復性、T7 核酸內(nèi)切酶酶切法檢測突變、PAGE 法檢測突變、野生型與突變體表型差異觀察。學生通過虛擬仿真實驗“教學模式”“練習模式”和“考核模式”3 個模式的遞進式學習，掌握采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術構建并鑒定突變體的方法。實驗過程中，學生須掌握實驗儀器和用具使用、實驗步驟和注意事項等相關知識和技能?？紤]到部分虛擬仿真實驗較難充分展示操作細節(jié)的情況，特地為這部分實驗加入實體實驗操作視頻，學生可配合實體操作視頻的觀看和學習，加強對實驗的實體感性認識。

3 實驗教學設計

擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯實驗教學可采用“線上線下、虛實結合”的混合式教學模式[10]，如圖2 所示。

圖2 擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯實驗教學設計

3.1 課前自行學習和練習

課前學生通過虛擬仿真實驗系統(tǒng)了解實驗目的和實驗材料，通過動畫視頻、圖片和文字形式學習相關原理知識；自主開展虛擬仿真實驗操作學習，結合實體操作教學視頻，通過多次反復練習相關實驗操作，初步掌握相關實驗技能，并在達到一定熟練程度后，完成線上考核。

3.2 課堂實體實驗教學

實體實驗課堂上，教師先組織學生進行討論交流，并對學生有疑問的部分開展重點講解；組織學生開展部分內(nèi)容的實體實驗，主要為突變體鑒定相關實驗，包括擬南芥基因組提取、PCR 擴增靶基因、基因片段產(chǎn)物變性復性、PAGE 法鑒定突變體等。

3.3 課后鞏固和評價

課后學生進行線上知識回顧和操作鞏固，撰寫實驗報告；教師結合學生線上考核成績和線下考核成績進行綜合評價，實現(xiàn)虛擬實驗與實體實驗在教學過程和教學評價方面的相互結合和補充。

4 實驗系統(tǒng)的特色

4.1 依托教研結合，增強學生實踐和創(chuàng)新能力

結合實驗教學的實際經(jīng)驗和需求，圍繞科學前沿并利用學科優(yōu)勢，以前期科學研究成果為依托，將前沿性科研成果轉(zhuǎn)化為典型教學案例，本文設計并建設了兼具科學性和先進性的擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯虛擬仿真綜合性實驗教學系統(tǒng)。該系統(tǒng)促進了科研與教學的有機融合，拓展了實驗教學內(nèi)容的廣度和深度，加強了學生知識技能與科學研究之間的銜接，有利于培養(yǎng)學生的科研實踐能力和綜合創(chuàng)新能力，符合實驗教學和人才培養(yǎng)的需求。

4.2 注重興趣引導，激發(fā)學生求知欲和科研興趣

本實驗系統(tǒng)改變了傳統(tǒng)教學中學生被動接受的學習方式，通過啟發(fā)學生思維，調(diào)動學生學習的主動性和自覺性，讓學生在學習過程中獨立思考，從而融會貫通地掌握知識，提高分析問題和解決問題的能力。本實驗系統(tǒng)通過課前“緒論式”短視頻啟發(fā)學生對本實驗科學性和前沿性的認識，激發(fā)學生求知欲；通過三維模擬動畫和圖片，將教學中晦澀難懂的原理變?yōu)闂l理清晰的視頻圖像，幫助學生深入理解相關知識要點；運用虛擬仿真技術，給學生接近真實的實驗操作體驗，充分發(fā)揮學生自主學習的主觀能動性，提高學生科研興趣和能力；配合課堂討論和實體實驗操作，進一步引導學生深入思考，培養(yǎng)學生科研實踐能力，提升實驗教學質(zhì)量。

4.3 強調(diào)虛實結合，構建全面知識系統(tǒng)和技能體系

本實驗系統(tǒng)注重將虛擬實驗和實體實驗有機融合，構建虛實結合的實驗教學模式[11]。虛擬實驗體現(xiàn)教學資源的綜合性，學生通過隨時隨地的線上學習獲得完整的知識體系并體驗系統(tǒng)化的實驗流程。實體實驗側(cè)重教師引導和實際操作體驗，學生在教師指導下完成部分實體實驗（圖2）。虛實的有機配合有利于學生構建完整的知識體系和開展全面系統(tǒng)的實驗訓練，從而達到實驗教學和科研訓練的培養(yǎng)目標。此外，對于部分虛擬仿真實驗較難充分展示操作細節(jié)的情況，在虛擬仿真實驗系統(tǒng)中加入直觀、真實的實體實驗操作視頻，使學生在虛擬實驗過程中加強實體感性認識，進一步強化虛實結合。

5 結語

擬南芥CRISPR/Cas9 基因編輯虛擬仿真實驗基于前期科研成果和實驗教學經(jīng)驗構建，解決了遺傳學實驗實體教學中因其綜合性強、技術性強、耗時長、難度大、時效性強而難以完全開展的困難，在提高教學質(zhì)量和學生實踐創(chuàng)新能力方面發(fā)揮重要作用。所構建的實驗系統(tǒng)兼具科學性和前沿性，可為高校生命科學相關專業(yè)實驗教學、科研訓練以及相關技術部門實驗培訓提供優(yōu)質(zhì)教學資源。后續(xù)將進一步優(yōu)化和完善實驗內(nèi)容和軟硬件條件，提高共享能力并擴大共享范圍，助力本領域綜合創(chuàng)新型專業(yè)人才培養(yǎng)。