基于同步移相顯微干涉的血紅細(xì)胞形貌測(cè)量方法

徐君宜，袁 群，高志山，徐 堯

（1.南京理工大學(xué) 電子工程與光電技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210094；2.江蘇曙光光電有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225109）

引言

血紅細(xì)胞的形貌特征是醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其體積過(guò)大或者過(guò)小、形貌發(fā)生異化等可以為包括貧血、白血病等在內(nèi)的多種血液疾病[1]、高血壓[2]和惡性腫瘤[3]等疾病提供診斷依據(jù)。因此，通過(guò)檢測(cè)血紅細(xì)胞的形貌，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期預(yù)防和診斷。傳統(tǒng)的血紅細(xì)胞形貌檢測(cè)方法多數(shù)需要對(duì)血紅細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記[4]，雖然可以獲得較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的傷害，對(duì)細(xì)胞的生理行為造成干擾[5-6]。

成熟的血紅細(xì)胞是無(wú)核的，可以看作折射率分布均勻的透明體，細(xì)胞厚度的變化會(huì)改變透射光的相位。因此，依據(jù)相位變化可以反演出細(xì)胞的大小、厚度等形貌信息。這種測(cè)量血紅細(xì)胞形貌的方法就是免標(biāo)記相位檢測(cè)技術(shù)。如今，該方法憑借其免標(biāo)記、無(wú)損傷的優(yōu)點(diǎn)快速發(fā)展，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

定量相位測(cè)量主要基于干涉法，并將干涉和顯微相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)非接觸、高精度的測(cè)量。傳統(tǒng)的細(xì)胞相位測(cè)量主要是針對(duì)靜態(tài)的生物細(xì)胞樣本，測(cè)量前提是忽略樣本隨時(shí)間的變化量。美國(guó)麻省理工學(xué)院激光生物醫(yī)學(xué)研究中心G.Popescu 研究組在2004年提出了傅里葉相位顯微技術(shù)（FPM）[7]，該技術(shù)結(jié)合了干涉和顯微技術(shù)，利用分時(shí)相移采集四幅干涉圖。但該方法只能測(cè)量靜態(tài)樣品，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)包括細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)等細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行相位檢測(cè)。自2012年以來(lái)，動(dòng)態(tài)細(xì)胞定量相位測(cè)量技術(shù)得到了快速發(fā)展，出現(xiàn)了多種相位檢測(cè)的新技術(shù)[8]。北京理工大學(xué)的李帥帥于2015年在分步移相干涉顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上，提出了基于同步移相干涉測(cè)量細(xì)胞高度的方法[9]。該系統(tǒng)類(lèi)似馬赫曾德?tīng)栂到y(tǒng)，設(shè)計(jì)了分光相移系統(tǒng)，通過(guò)一次拍攝采集四幅干涉圖，通過(guò)該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞高度的測(cè)量。浙江大學(xué)的凌瞳等人在2017年提出了一種基于隨機(jī)編碼混合光柵的寬帶靈敏度增強(qiáng)干涉顯微技術(shù)，利用兩個(gè)四波前橫向剪切干涉儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量相位成像[10-11]，用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)提取血紅細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相位。

現(xiàn)有的血紅細(xì)胞形貌檢測(cè)手段雖然實(shí)現(xiàn)了對(duì)活體血紅細(xì)胞的相位檢測(cè)，但是只對(duì)離體細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，未能對(duì)在體微血管內(nèi)的血紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。本課題組的前期工作設(shè)計(jì)了反射式同步移相顯微干涉系統(tǒng)，測(cè)量了模擬微血管內(nèi)的血紅細(xì)胞形貌[12]。但是該系統(tǒng)是基于反射式的光路結(jié)構(gòu)，光路兩次經(jīng)過(guò)樣品會(huì)帶來(lái)較大的像差，因此復(fù)原出的血紅細(xì)胞形貌不夠準(zhǔn)確。透射式同步移相顯微干涉成像系統(tǒng)是把同步移相技術(shù)與激光顯微干涉技術(shù)相結(jié)合，結(jié)合了同步移相技術(shù)抗振性能好、實(shí)時(shí)性好，以及透射式干涉顯微技術(shù)光路簡(jiǎn)單、像差引入小和空間分辨率高的優(yōu)點(diǎn)。因此，本文提出將該方法用于微血管內(nèi)血紅細(xì)胞的相位測(cè)量，并恢復(fù)出微血管內(nèi)血紅細(xì)胞的形貌，在系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建、相位提取、放大率校正、形貌復(fù)原等方面開(kāi)展了相關(guān)研究工作。

1 原理及算法

1.1 測(cè)量原理

哺乳動(dòng)物成熟的血紅細(xì)胞是雙凹圓盤(pán)結(jié)構(gòu)，尺寸信息如圖1所示，直徑為7.0 μm～8.5 μm，最高高度為2.4±0.1 μm，最低高度為1.0±0.8 μm，可以看作是折射率為常數(shù)的透射樣品。

圖1 人血紅細(xì)胞尺寸圖Fig.1 Size of human red blood cells

正常的血紅細(xì)胞折射率為1.395，血漿的折射率為1.335。當(dāng)探測(cè)光經(jīng)過(guò)均勻介質(zhì)時(shí)，折射率的差值會(huì)導(dǎo)致光程差的變化。光程表達(dá)式為

式中：l為光程；n為介質(zhì)折射率；s為光走過(guò)的距離；c為光速；v為光在介質(zhì)中傳播的速度。由于正常血紅細(xì)胞與周?chē)獫{折射率存在差異，當(dāng)探測(cè)光束一部分通過(guò)血紅細(xì)胞，另一部分不通過(guò)血紅細(xì)胞時(shí)，就會(huì)存在光程的差異。如圖2所示，一束探測(cè)光束垂直通過(guò)血液，取其中的細(xì)光束a和b來(lái)討論。

圖2 血紅細(xì)胞與周?chē)獫{光程差變化示意圖Fig.2 Change of optical path difference between red blood cells and surrounding plasma

將光束a的光程記作la，光束b的光程記作lb，光束a和光束b光程差的絕對(duì)值記作|?l|=|la?lb|，血漿折射率記作np，血紅細(xì)胞折射率記作nRBC，光通過(guò)血紅細(xì)胞的幾何路程記作dRBC，光通過(guò)血管的幾何路程記作dp，可以得到：

由（4）式可以計(jì)算出光通過(guò)血紅細(xì)胞的幾何路程為

由此可知，在血紅細(xì)胞和血漿折射率已知的情況下，只要求出光程差的值，就可以精確地求得光在血紅細(xì)胞中通過(guò)的幾何路程。相位差 ?φ與光程差 ?l的關(guān)系為

式中：λ是探測(cè)光的波長(zhǎng)，當(dāng)使用本文提出的同步移相顯微干涉方法檢測(cè)樣品時(shí)，結(jié)合（4）式和（6）式，可以得到血紅細(xì)胞在光軸方向的厚度d為

1.2 實(shí)驗(yàn)光路

本文設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)光路如圖3所示。He-Ne 穩(wěn)頻激光器發(fā)出一束波長(zhǎng)632.8 nm的線(xiàn)偏振光，經(jīng)過(guò)擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)后，經(jīng)過(guò)與x軸夾角θ的偏振片，然后經(jīng)過(guò)偏振分光棱鏡1 分成兩束偏振方向正交的參考光（P光）和測(cè)試光（S光）。測(cè)試光經(jīng)過(guò)樣品和顯微物鏡后，出射光是發(fā)散的，經(jīng)過(guò)與顯微物鏡共焦放置的成像透鏡后平行出射。參考光和測(cè)試光分別經(jīng)過(guò)反射鏡折反后，經(jīng)偏振分光棱鏡2 合束成為沿相同方向傳播的兩束偏振態(tài)正交的平行光束。然后兩束偏振態(tài)正交的平行光經(jīng)過(guò)快軸與x軸成45°的λ/4 波片，參考光和測(cè)試光分別變成左旋和右旋圓偏光，此時(shí)兩束光由于偏振態(tài)正交而無(wú)法發(fā)生干涉，最后成像在微偏振片陣列相機(jī)靶面上。微偏振陣列是由一系列不同偏振方向的微偏振片規(guī)律排列組成的，這些偏振片的透光軸分沿與x軸成0°、45°、90°、135°夾角的4個(gè)方向。因此，參考光和測(cè)試光僅在這4個(gè)方向上發(fā)生干涉，分別得到0、π/2、π、3π/2的相位延遲量，然后經(jīng)過(guò)CCD 進(jìn)行圖像采集，同時(shí)獲得四幅移相干涉圖。最后，采用四步移相算法進(jìn)行相位提取，采用質(zhì)量圖引導(dǎo)法進(jìn)行相位解包處理，得到被測(cè)樣品的相位信息[13-15]。

圖3 透射式同步移相顯微干涉光路圖Fig.3 Optical path of transmission-type simultaneous phaseshifting microscopic interference

1.3 微血管中血紅細(xì)胞形貌的提取方法

干涉檢測(cè)系統(tǒng)自身可看成一個(gè)像差完善校正或者像差受限的系統(tǒng)，但模擬微血管作為一種管狀結(jié)構(gòu)，將在檢測(cè)光路中引入較大的像差。血紅細(xì)胞位于模擬微血管中，其形貌引入的相位變化相當(dāng)于在模擬微血管引入的較大像差基礎(chǔ)上再引入一個(gè)微小像差變化。而對(duì)于血紅細(xì)胞的形貌測(cè)量來(lái)說(shuō)，其高度和直徑等尺寸信息是必要的測(cè)量結(jié)果，因此如何在波前相位圖中提取出微弱的血紅細(xì)胞相位信息是需要考慮的問(wèn)題。

本文提出一種于微血管波面相減的血紅細(xì)胞形貌求解方法，即在同一位置分別采集模擬微血管干涉圖和通有血紅細(xì)胞的微血管干涉圖，分別計(jì)算獲取相位后，直接相減扣除微血管附加的相位影響。步驟如下：

1） 采集未通有血紅細(xì)胞的模擬微血管干涉圖，進(jìn)行相位提取和相位解包，得到波面W1；

2） 在相同位置采集通有血紅細(xì)胞的模擬微血管干涉圖，進(jìn)行相位提取和相位解包，得到波面W2；

3） 求波面W2和波面W1之間的殘差ERROR=W2?W1；

4） 提取出血紅細(xì)胞的相位φRBC，并恢復(fù)出形貌。

2 實(shí)驗(yàn)與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

干涉光源是Thorlabs公司的HRS015B型He-Ne 穩(wěn)頻激光器，工作波長(zhǎng)為632.8 nm；成像透鏡是Thorlabs公司的雙膠合消色差透鏡，工作波長(zhǎng)范圍為400 nm～700 nm，焦距f1為400 mm；顯微物鏡選擇了金相平場(chǎng)消色差50X 明場(chǎng)顯微物鏡，其參數(shù)NA為0.55，有效工作距為8.2 mm，焦距f2為4 mm，焦深為0.9 μm，物方視場(chǎng)為0.5 mm。可計(jì)算得到該顯微物鏡的理論分辨率為0.61λ/NA=0.7051 μm，與成像物鏡組成的系統(tǒng)放大率為β=f1/f2=100。通過(guò)對(duì)系統(tǒng)的放大倍率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)標(biāo)定，得到系統(tǒng)的實(shí)際放大率為101.6倍。微偏振陣列相機(jī)選擇了4D Technology公司的PolarCam V型號(hào)微偏振片陣列相機(jī)，該相機(jī)的工作波段為350 nm ～1060 nm，靶面上像素單元的尺寸為7.4 μm，像素?cái)?shù)為640×450 pixels。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品

模擬微血管樣品由以下幾個(gè)部分組成：用內(nèi)徑為100 μm、折射率為1.47的玻璃毛細(xì)管模擬微血管；用折射率為1.45的光纖折射率匹配液模擬血管周?chē)慕M織；用厚度為0.13 mm的顯微鏡蓋玻片和厚度為1.1 mm的高清免洗載玻片夾持血管樣品；用折射率為1.395的新西蘭兔血紅細(xì)胞模擬人的血紅細(xì)胞，其直徑為7 μm～8 μm，最高高度為2 μm 左右；用折射率為1.3346的阿氏液模擬血漿。

取長(zhǎng)度適中的玻璃毛細(xì)管，利用毛細(xì)現(xiàn)象將血紅細(xì)胞吸入毛細(xì)管內(nèi)；然后，在一塊干凈的載玻片中心處滴一滴光纖折射率液，將毛細(xì)管緩慢置于折射率液中間。最后，從一側(cè)將蓋玻片緩慢蓋下，避免產(chǎn)生氣泡。

2.3 微血管中血紅細(xì)胞形貌的放大率校正

模擬微血管的存在不僅會(huì)引入像差，也會(huì)對(duì)管中樣品的放大率帶來(lái)影響。因此，在ZEMAX 中按照?qǐng)D4所示的物像關(guān)系進(jìn)行仿真，將模擬微血管橫截面設(shè)為y-z平面，管軸方向設(shè)為x方向，光沿z軸傳播。由仿真結(jié)果可知，物經(jīng)過(guò)系統(tǒng)放大100倍后的像，在x軸方向的放大倍率為105.9，在y軸方向的放大倍率為93.4。

圖4 物像關(guān)系圖Fig.4 Relationship between object and image

由前文放大率標(biāo)定結(jié)果可知，系統(tǒng)的實(shí)際放大率為101.6倍，結(jié)合仿真結(jié)果，對(duì)系統(tǒng)的放大率進(jìn)行校正：x方向的放大倍率為107.6，y方向的放大倍率為94.9。

2.4 微血管內(nèi)血紅細(xì)胞相位的提取

在模擬微血管內(nèi)通入血漿并進(jìn)行干涉圖采集，然后通入帶有血紅細(xì)胞的血漿并進(jìn)行干涉圖采集。圖5分別是模擬微血管內(nèi)的血紅細(xì)胞的移相干涉圖5（a）、通有血紅細(xì)胞的模擬微血管波面圖5（b）、未通有血紅細(xì)胞的模擬微血管波面圖5（c）和計(jì)算得到的殘差圖5（d）。

圖5 微血管內(nèi)血紅細(xì)胞形貌測(cè)量結(jié)果圖Fig.5 Measurement results of profile for red blood cell in microvessel

對(duì)比通有血紅細(xì)胞的模擬微血管的波面圖和殘差圖可以發(fā)現(xiàn)，在直接相位解包得到的模擬微血管內(nèi)的血紅細(xì)胞相位圖中，血紅細(xì)胞被淹沒(méi)在模擬微血管的相位中難以分辨，殘差圖中可以輕易分辨出血紅細(xì)胞的相位信息。截取殘差圖中的血紅細(xì)胞，并進(jìn)行高度信息計(jì)算。圖6是單個(gè)血紅細(xì)胞的三維形貌圖6（a）和橫截面高度圖6（b）。

圖6 單個(gè)血紅細(xì)胞形貌測(cè)量結(jié)果圖Fig.6 Measurement results of profile for single red blood cell

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

對(duì)微血管內(nèi)的血紅細(xì)胞進(jìn)行了20組形貌測(cè)量實(shí)驗(yàn)，得到20組數(shù)據(jù)，如表1所示。根據(jù)表1統(tǒng)計(jì)可以得到細(xì)胞的平均最高高度和平均直徑分別為2.022 μm和7.857 μm；最高高度和直徑的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.044 μm和0.210 μm。

表1 微血管內(nèi)血紅細(xì)胞直徑和最高高度Table1 Diameter and maximum height of red blood cells in microvessel

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得到的平均直徑和平均最高高度在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞尺寸范圍內(nèi)，并且標(biāo)準(zhǔn)差較小，因此可以認(rèn)為本系統(tǒng)具有測(cè)量并基本準(zhǔn)確復(fù)原微血管內(nèi)血紅細(xì)胞形貌的能力。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并搭建了透射式同步移相顯微干涉成像系統(tǒng)，提出了一種基于微血管相位相減的血紅細(xì)胞相位提取方法。在ZEMAX 中對(duì)系統(tǒng)的成像關(guān)系進(jìn)行仿真，校正了系統(tǒng)的放大倍率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量了內(nèi)徑100 μm模擬微血管內(nèi)血紅細(xì)胞相位的形貌。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了本文提出的方法具有測(cè)量微血管內(nèi)血紅細(xì)胞的相位并準(zhǔn)確復(fù)原形貌的能力，為該系統(tǒng)在此方向的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。