酵母菌為原料制備生物柴油工藝研究

王希越，王洪偉，王月，石一雯，連麗麗，婁大偉

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2 吉林省中北化工工程設(shè)計有限公司，吉林 吉林 132000)

目前，石化能源的日益枯竭及環(huán)境污染問題備受關(guān)注[1]，生物柴油是一種可替代傳統(tǒng)石油的可再生生物清潔能源，具有良好的環(huán)保性能，安全、可再生及可降解等特點，目前生物柴油的開發(fā)已成為國際新能源研究的熱點[2-3]。

生物柴油利用各類油脂與短鏈醇經(jīng)過油脂酯化或者酯交換轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生[4-5]。其原料來源較多，其中微生物油脂，如酵母菌、微藻具有培養(yǎng)簡單、生長速度快、油脂含量高特點，是理想的油脂原料[6-8]。目前酵母菌被當(dāng)作油脂原料的相關(guān)報道還比較少。本文以酵母菌為原料，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對酵母菌為原料制備生物柴油的工藝方法進行研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正己烷、甲基叔丁基醚、甲醇均為色譜純；氯仿、氯化鈉、氫氧化鉀均為分析純。

7890B氣相色譜儀；M7-300EI質(zhì)譜儀；H1650離心機；XW-904微型漩渦混合儀；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器；BSD-YX3200智能精密搖床；N-EVAP111氮吹儀。

1.2 GC-MS條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱Agilent HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進樣口溫度260 ℃，程序升溫條件：初始柱溫150 ℃，20 ℃/min速率升到214 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min速率升到280 ℃，保持 5 min，分流比10∶1，載氣為氦氣(純度99.999 5%)，流速1.2 mL/min，總流量16.20 mL/min，進樣量1 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲時間2 min，掃描模式為SIM(選擇離子掃描)。

1.3 樣品制備

1.3.1 酵母菌培養(yǎng) 從瓊脂平板上挑取單菌落到裝有10 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，放到搖床中，在30 ℃、200 r/min條件下，活化培養(yǎng)12 h。然后取一定量菌液到50 mL新的YPD液體培養(yǎng)基中，使初始OD600=0.2，在30 ℃，200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng) 9 h 到對數(shù)生長期。然后離心5 min，棄上清液；菌體再用蒸餾水洗滌1次，再次離心，倒出上清液，菌體移入稱量盤中，干燥后儲存，用于下一步的研究。

1.3.2 實驗過程

1.3.2.1 油脂提取 準(zhǔn)確稱取50 mg酵母干粉于玻璃離心管中，加入300 μL的甲醇、50 μL的二次去離子水，超聲10 min。再加入1 mL甲基叔丁基醚，室溫下振蕩1 h。然后加入300 μL的5% NaCl溶液，渦旋混勻1 min，靜置10 min，放入離心機中，3 000 r/min 離心10 min，取上清液氮氣吹干。

1.3.2.2 酯化過程 加入300 μL的正己烷，渦旋30 s，再加入400 μL 0.05 mol/L KOH-甲醇溶液，25 ℃ 水浴恒溫反應(yīng)3 h。加入5%的NaCl溶液 300 μL，渦旋1 min混勻，靜置10 min，10 000 r/min離心5 min，取上層于2.0 mL的離心管中。剩下的溶液加入600 μL的正己烷再次提取，2次取得上清液混合氮氣吹干。最后加入100 μL的正己烷溶解，進樣1 μL，進行GC-MS分析。

1.3.3 實驗重復(fù)性考察 準(zhǔn)確稱取6份50 mg酵母干粉于玻璃離心管中，按1.3.2節(jié)方法處理后進行GC-MS分析，計算6份樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

酵母菌體內(nèi)油脂經(jīng)提取和酯化后制得生物柴油，經(jīng)GC-MS分析，其主要成分為肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、十六烯酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯，以酯的總含量為評價指標(biāo)，對影響酯化和萃取條件的因素進行考察。

2.1 催化劑KOH濃度影響

在酯化過程中，加入KOH催化劑促進反應(yīng)進行，實驗考察不同濃度KOH對酯化影響，分別加入0.01，0.05，0.10，0.20，0.60 mol/L的KOH-CH3OH溶液，40 ℃下恒溫水浴2 h，其他條件相同。酯總量與KOH濃度關(guān)系結(jié)果見圖1。

由圖1可知，當(dāng)KOH濃度0.05 mol/L時，得到生物柴油總量最多，當(dāng)KOH濃度繼續(xù)增大時，生物柴油量逐漸減少。所以最佳KOH濃度為 0.05 mol/L。

圖1 催化劑(KOH)濃度對柴油產(chǎn)量影響Fig.1 The effect of catalyst concentration on biodiesel yield

2.2 考察衍生試劑甲醇用量

油脂酯化反應(yīng)中以甲醇作為反應(yīng)試劑，考察100，200，400，600，800 μL甲醇對酯化影響，結(jié)果見圖2。

圖2 甲醇用量對柴油產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of methanol dosage on the biodiesel yield

由圖2可知，伴隨著甲醇用量的增加，得到酯的總量逐漸增加，加入400 μL甲醇時酯的總量最多；隨后，隨甲醇加入量增加，酯總量反而減少，這可能是由于加入甲醇量過多，降低反應(yīng)物濃度，抑制酯化反應(yīng)。

2.3 考察酯化時間

在最佳KOH和甲醇用量條件下，對酯化時間進行考察，圖3顯示酯化時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 h得到酯總含量。

圖3 酯化時間的影響Fig.3 The effect of reaction time on biodiesel production

由圖3可知，隨時間增加，酯化越完全，酯總量越多。

2.4 重復(fù)性考察

在最佳工藝條件下，通過對6組平行樣中5種酯進行定量分析，包括C14∶0(肉豆蔻酸甲酯)、C16∶1(棕櫚油酸甲酯)、C16∶0(棕櫚酸甲酯)、C18∶1(油酸甲酯)、C18∶0(硬脂酸甲酯)，結(jié)果見表1。

表1 生物柴油中脂肪酸甲酯相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 The relative standard deviation of fatty acid methyl ester in biodiesel

由表1可知，6組平行樣中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說明該方法重復(fù)性較好。

3 結(jié)論

本實驗以酵母菌為原料，對傳統(tǒng)兩步法制備生物柴油的工藝進行研究，確定酯化50 mg酵母粉中油脂，使用催化劑KOH用量、衍生試劑甲醇用量和酯化時間最佳條件分別為：0.05 mol/L、400 μL、3 h，氣相色譜質(zhì)譜分析生物柴油成分主要為C16∶0(棕櫚酸甲酯)、C18∶0(硬脂酸甲酯)、C14∶0(肉豆蔻酸甲酯)、C16∶1(棕櫚油酸甲酯)、C18∶1(油酸甲酯)。通過重復(fù)性實驗考察可知，在最佳工藝條件下，該方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性強。