響應面法優(yōu)化百合多糖的超聲輔助提取工藝

侯敏娜,侯少平,吳滿芳，劉艷紅，彭修娟，許海燕

(1．陜西國際商貿(mào)學院,陜西 咸陽 712046；2.都昌縣第二人民醫(yī)院，江西 九江332600)

百合(Liliumbrownii)為百合科百合屬植物卷丹的干燥肉質鱗葉[1]，味甘性寒，歸心肺二經(jīng)，具有較高的食用和藥用價值。百合含有多糖、甾體皂甙、酚類化合物、黃酮類化合物和生物堿等多種活性成分，其中多糖含量較高[2-3]，用于治療咳嗽痰多、心煩驚悸、失眠等癥[4-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，百合在抗疲勞、抗抑郁、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、免疫調節(jié)、止咳等[7-10]方面有很好的療效。植物多糖的提取方法主要有溶劑法、酶法、超聲輔助法、微波法等。作者采用超聲輔助法提取百合多糖，在單因素實驗的基礎上，以液料比、提取時間、超聲功率、提取次數(shù)為考察因素，以百合多糖得率為評價指標，采用響應面法優(yōu)化百合多糖的提取工藝，以期為百合多糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

百合，購于甘肅蘭州中藥材批發(fā)市場，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學院中藥教研室雷國蓮教授鑒別為百合科百合屬植物卷丹。

葡萄糖標準品(批號2014041)，中國藥品生物制品鑒定所；濃硫酸，天津化學試劑有限公司；苯酚，天津盛奧化學試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

KQ5200DE型超聲波提取儀，昆山超聲儀器有限公司；TGL-15B型離心機，上海安平科學儀器廠；TU-1810型紫外分光光度計，上海長城制造有限公司；YP20002型電子天平，上海越平科學儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 百合多糖的提取及精制

將干燥的百合藥材切成小片，置于干凈的燒杯中，按一定液料比加入適量蒸餾水，浸泡1 h。將浸泡液超聲提取后，抽濾，濾液濃縮至原溶液體積的1/4，加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜，沉淀即為百合粗多糖。將百合粗多糖加入氯仿-正丁醇混合液中，采用Sevag法[11-12]除去蛋白質，即得精制后的百合多糖。

1.3 百合多糖得率的測定

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

將葡萄糖標準品置于105 ℃干燥箱中干燥至恒重，精密稱取0.005 0 g，置于50 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。分別精密吸取葡萄糖標準溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于20 mL容量瓶中，加蒸餾水至2 mL；再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，取出，冰水冷卻10 min；另取2.0 mL蒸餾水作空白對照；測定490 nm處吸光度。以葡萄糖濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 百合多糖得率的計算

將百合多糖置于60 ℃干燥箱中干燥后，精密稱取4 mg，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得樣品溶液。精密吸取樣品溶液1 mL，按1.3.1方法測定百合多糖在490 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線計算多糖濃度，按下式計算百合多糖得率(Y)[13-14]：

式中：c為多糖濃度， mg·mL-1；V為溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為百合質量，mg。

1.4 百合多糖超聲輔助提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實驗

分別考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g，下同)、提取時間(3 min、4 min、5 min、6 min、7 min)、超聲功率(300 W、400 W、500 W、600 W、700 W)、提取次數(shù)(1次、2 次、3 次)對百合多糖得率的影響，確定各因素的適宜范圍[15-19]。

1.4.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，以百合多糖得率為評價指標，以液料比(A)、提取時間(B)、超聲功率(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素進行4因素3水平Box-Behnken實驗,設計29組響應面實驗優(yōu)化提取工藝。響應面實驗的因素與水平見表1。

表1 響應面實驗的因素與水平

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線(圖1)

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

擬合得葡萄糖的線性回歸方程為：A=0.9703c+0.0175，R2=0.9982。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 液料比對百合多糖得率的影響

在超聲功率為400 W、提取時間為5 min、提取2次的條件下，考察液料比對百合多糖得率的影響，結果見圖2。

圖2 液料比對百合多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-soild ratio on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖2可以看出，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，百合多糖得率先升高后降低，當液料比為20∶1時，百合多糖得率達到最高，為1.97%?？梢猿醪酵茢?，溶劑用量過少時，多糖不能充分溶出；溶劑用量過多時，會引入更多的雜質，導致多糖得率降低。故選擇20∶1為液料比的中心實驗點。

2.2.2 提取時間對百合多糖得率的影響

在超聲功率為400 W、液料比為20∶1、提取2次的條件下，考察提取時間對百合多糖得率的影響，結果見圖3。

圖3 提取時間對百合多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖3可以看出，隨著提取時間的延長,百合多糖得率先升高后降低，當提取時間為4 min時，百合多糖得率達到最高，為1.93%。提取時間較短(少于4 min)時，提取不完全，多糖得率低；當提取時間較長(超過4 min)時，多糖結構可能被破壞，使得多糖含量減少。故選擇4 min為提取時間的中心實驗點。

2.2.3 超聲功率對百合多糖得率的影響

在液料比為20∶1、提取時間為4 min、提取2次的條件下，考察超聲功率對百合多糖得率的影響，結果見圖4。

圖4 超聲功率對百合多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖4可以看出，隨著超聲功率的增大,百合多糖得率先升高后降低而后趨于穩(wěn)定，當超聲功率為400 W時，百合多糖得率達到最高，為1.98%?？赡苁且驗?，超聲功率較小時，超聲波能量較低，不能有效提取多糖；當超聲功率過大時，一些非糖物質也被提取出來，影響多糖測定，致使多糖得率降低。故選擇400 W為超聲功率的中心實驗點。

2.2.4 提取次數(shù)對百合多糖得率的影響

在液料比為20∶1、提取時間為4 min、超聲功率為400 W的條件下，考察提取次數(shù)對百合多糖得率的影響，結果見圖5。

圖5 提取次數(shù)對百合多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖5可以看出，百合多糖得率在超聲提取2次時達到最高，為2.96%，超過2次后明顯下降。可能是由于，連續(xù)2次的提取使多糖的結構被破壞或者物料的水溶液變得黏稠，多糖溶出困難。故選擇2次為提取次數(shù)的中心實驗點。

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計與結果(表2)

表2 響應面實驗設計與結果

2.3.2 回歸模型的建立和方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到多元二次回歸模型方程為：Y=12.76+0.38A+0.72B+0.17C+0.28D-0.14AB-0.25AC+0.57AD+0.81BC-0.13BD+0.060CD-0.35A2-0.084B2-0.81C2-1.49D2。

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析

即該模型可以解釋 93.58%響應值的變化，模型擬合程度較好，說明該模型可以對不同條件下百合多糖得率進行預測。此外，提取時間的一次項和提取次數(shù)的二次項高度顯著，提取時間和超聲功率的交互項、超聲功率的二次項極顯著。由F值可以得出各因素影響百合多糖得率的大小依次為：提取時間(B)>液料比(A)>提取次數(shù)(D)>超聲功率(C)。

2.3.3 響應面分析

根據(jù)回歸分析結果，使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用對百合多糖得率影響的響應面圖和等高線圖，結果見圖6。

由圖6a可以看出，液料比與提取時間的響應曲面均向下彎曲，但液料比的彎曲程度更大，表明液料比的二次項對百合多糖得率影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍：液料比(15～20)∶1、提取時間3～4 min,在此范圍內百合多糖得率最高。

圖6 各因素交互作用對百合多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface map and contour map for effect of interaction between each factor on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖6b可以看出，液料比與超聲功率的響應曲面均向下彎曲，超聲功率的彎曲程度更大，表明超聲功率的二次項對百合多糖得率的影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：液料比(20～30)∶1、超聲功率400～500 W，在此范圍內百合多糖得率最高。

由圖6c可以看出，液料比與提取次數(shù)的響應曲面均向下彎曲，提取次數(shù)的坡度更陡，表明提取次數(shù)的二次項對百合多糖得率的影響較大。等高線呈橢圓形，二者的交互作用顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：液料比(20～30)∶1、提取次數(shù)2～3次，在此范圍內百合多糖得率最高。

由圖6d可以看出，提取時間與超聲功率的響應曲面均向下彎曲，超聲功率的彎曲程度更大，表明超聲功率的二次項對百合多糖得率的影響更大。等高線呈橢圓形，二者的交互項顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：超聲功率400～500 W、提取時間3～4 min，在此范圍內百合多糖得率最高。

由圖6e可以看出，提取時間與提取次數(shù)的響應曲面都有彎曲，兩者對百合多糖的得率均有影響，提取次數(shù)的彎曲程度更大，故對百合多糖得率的影響更大。等高線接近圓形，二者的交互作用不顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：提取時間3～4 min、提取次數(shù)2～3次，在此范圍內百合多糖得率最高。

由圖6f可以看出，超聲功率與提取次數(shù)的響應曲面均向下彎曲，提取次數(shù)的坡度更陡，說明提取次數(shù)的二次項對百合多糖得率的影響更大。等高線呈橢圓形，二者的交互作用顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：提取功率400～500 W、提取次數(shù)2～3次，在此范圍內百合多糖得率最高。

2.4 工藝驗證

通過響應面法處理實驗數(shù)據(jù)得到百合多糖的最佳超聲輔助提取工藝為：液料比20.5∶1、提取時間4.3 min、超聲功率400 W、提取次數(shù)2次，百合多糖預測得率為13.150%?？紤]實際操作情況，將最佳超聲輔助提取工藝修正為：液料比21∶1、提取時間4 min、超聲功率400 W、提取次數(shù)2次。在此條件下，進行3次驗證實驗，百合多糖平均得率為12.936%，與百合多糖得率預測值(13.150%)接近。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，以液料比、提取時間、超聲功率、提取次數(shù)為考察因素，以百合多糖得率為評價指標，采用響應面法優(yōu)化了百合多糖的超聲輔助提取工藝。確定最佳提取工藝為：液料比21∶1 (mL∶g)、提取時間4 min、超聲功率400 W、提取次數(shù)2次，在此條件下，百合多糖得率為12.936%，與預測值(13.150%)相差0.214%。