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    龍膽多糖的果膠酶法提取工藝及抗氧化活性研究

    2020-09-29 01:03:56程振玉
    化學(xué)與生物工程 2020年9期
    關(guān)鍵詞:龍膽草龍膽果膠酶

    付 晶,呂 洋,程振玉*

    (1.阜新市環(huán)境監(jiān)測中心站,遼寧 阜新 123000; 2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

    龍膽屬于龍膽科植物龍膽(GentianascabraBunge)、條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall.)的干燥根和莖,在臨床實(shí)踐中可用于保護(hù)人體的胃、肝、膽等器官,近年來在抗腫瘤方面也表現(xiàn)出了令人滿意的治療效果[1]。研究表明,多糖類物質(zhì)是龍膽草最主要的活性成分之一,具有降血糖[2]、降血脂、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、保肝[5]、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎等療效。目前,常采用熱水回流法[6]、微波法[7]、超聲波法[8]等提取龍膽多糖。熱水回流法提取溫度高,且提取率較低;超聲波法和微波法設(shè)備昂貴,且有可能引起糖苷鍵的斷裂。果膠酶法可以有效破壞植物細(xì)胞壁,使植物細(xì)胞內(nèi)的有效物質(zhì)充分溶出,且不破壞其活性,是一種非常有前景的提取技術(shù)[9]。果膠酶法具有提取溫度適中、操作方便、目標(biāo)成分得率高等優(yōu)點(diǎn),在黃酮類、木質(zhì)素、植物多糖等天然產(chǎn)物活性成分的提取中受到越來越多的關(guān)注。因此,作者以龍膽多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化龍膽多糖的果膠酶法提取工藝,并通過測定龍膽多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化活性,以期為工業(yè)化提取龍膽多糖奠定基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料、試劑與儀器

    龍膽草,市售;果膠酶,北京奧博新生物技術(shù)有限公司。

    苯酚、無水乙醇、葡萄糖對(duì)照品,分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;濃硫酸,分析純,天津天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

    FA2004型電子分析天平,上海精天電子儀器有限公司;DZF-6050型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D型循環(huán)水式真空泵,鞏義英峪儀器一廠;RT-08型多功能粉碎機(jī),榮聰精密科技有限公司;722型紫外可見分光光度計(jì),上海欣茂儀器有限公司。

    1.2 龍膽多糖的提取

    將干燥且粉碎的龍膽草過60目篩,準(zhǔn)確稱量1.0 g置于平底燒瓶中,加入一定質(zhì)量的果膠酶和一定體積的蒸餾水,在一定溫度下提取一段時(shí)間;抽濾,收集濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量;加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%進(jìn)行沉淀,靜置過夜;抽濾,收集濾餅,用無水乙醇洗滌3次,得龍膽多糖。

    1.3 龍膽多糖含量的測定

    采用苯酚-硫酸法[9]。以葡萄糖濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.0097c-0.0057,R2=0.9995。按下式計(jì)算龍膽多糖提取率:

    1.4 龍膽多糖提取工藝優(yōu)化

    1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

    采用單因素實(shí)驗(yàn),分別考察果膠酶用量(0.01 g、0.02 g、0.03 g、0.04 g、0.05 g)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,g∶mL,下同)、提取溫度(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃)、提取時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)、pH值(1、2、3、4、5、6、7)對(duì)龍膽多糖提取率的影響。

    1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

    在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[10-11]對(duì)影響多糖提取率的參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

    表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

    1.5 龍膽多糖的抗氧化活性評(píng)價(jià)

    參照文獻(xiàn)[10]方法,測定龍膽多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率,對(duì)龍膽多糖的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 果膠酶用量對(duì)龍膽多糖提取率的影響(圖1)

    圖1 果膠酶用量對(duì)龍膽多糖提取率的影響Fig.1 Effect of pectinase dosage on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

    酶用量對(duì)天然產(chǎn)物中活性成分的提取效果影響較大。由圖1可知,當(dāng)果膠酶用量由0.01 g增加到0.04 g時(shí),龍膽多糖提取率逐漸升高;但是進(jìn)一步增加果膠酶用量,提取率反而降低。因此,選擇最佳的果膠酶用量為0.04 g,即4%(以龍膽草質(zhì)量計(jì))。

    2.1.2 料液比對(duì)龍膽多糖提取率的影響(圖2)

    圖2 料液比對(duì)龍膽多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

    由圖2可知,當(dāng)料液比由1∶10減小到1∶40時(shí),即提取溶劑用量由10 mL增加到40 mL,龍膽多糖提取率逐漸升高;但是進(jìn)一步增加提取溶劑用量,提取率反而降低。原因可能是,提取溶劑用量較少時(shí),一些多糖尚未溶出,導(dǎo)致多糖提取率較低;但當(dāng)提取溶劑過多時(shí),雜質(zhì)亦會(huì)提取出來,從而抑制多糖的提取。因此,選擇最佳的料液比為1∶40。

    2.1.3 提取溫度對(duì)龍膽多糖提取率的影響(圖3)

    圖3 提取溫度對(duì)龍膽多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

    由圖3可知,當(dāng)提取溫度由35 ℃升至65 ℃時(shí),龍膽多糖提取率逐漸升高;但當(dāng)提取溫度超過65 ℃后,多糖提取率開始下降。原因可能是,隨著提取溫度的升高,果膠酶的活性也隨之增強(qiáng),大大提高了果膠酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度,利于多糖更加充分地溶出;但當(dāng)提取溫度過高時(shí),會(huì)使果膠酶部分失去活性或多糖糖苷鍵斷裂,影響多糖的溶出。因此,選擇適宜的提取溫度范圍為55~75 ℃。

    2.1.4 提取時(shí)間對(duì)龍膽多糖提取率的影響(圖4)

    圖4 提取時(shí)間對(duì)龍膽多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

    由圖4可知,在5 h內(nèi)時(shí),隨著提取時(shí)間的延長,龍膽多糖提取率逐漸升高。原因可能是,隨著提取時(shí)間的延長,果膠酶與龍膽草作用時(shí)間延長,從而使龍膽草的細(xì)胞壁被充分破壞,利于多糖的溶出;但當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí),雜質(zhì)亦會(huì)提取出來,從而抑制多糖的提取。因此,選擇適宜的提取時(shí)間范圍為4~6 h。

    2.1.5 pH值對(duì)龍膽多糖提取率的影響(圖5)

    圖5 pH值對(duì)龍膽多糖提取率的影響Fig.5 Effect of pH value on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

    由圖5可知,當(dāng)pH值在1~2之間時(shí),隨著pH值的增大,多糖提取率逐漸升高;但當(dāng)pH值超過2時(shí),多糖提取率反而下降。因此,選擇適宜的pH值范圍為1~3。

    2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(表2)

    采用多元回歸分析法,對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得果膠酶法提取龍膽多糖工藝的二元多次回歸方程為:Y=17.11-1.08A+1.09B-0.076C-0.51AB+1AC-0.29BC+0.59A2-3.28B2-2.84C2。

    模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察。回歸方程的方差分析見表3。

    由表3可知,模型的F=3.86,P<0.05,表明實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有顯著性。在總的作用因素中, pH值、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)龍膽多糖提取率的影響均不顯著;各考察因素對(duì)多糖提取率的影響不能用線性關(guān)系來表示,因素之間的交互作用影響不顯著。

    表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    表3 方差分析

    2.2.2 響應(yīng)面分析

    各因素交互作用對(duì)龍膽多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖6。

    圖6 各因素交互作用對(duì)龍膽多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

    由圖6可知,提取時(shí)間和提取溫度兩個(gè)因素對(duì)龍膽多糖提取率的影響較顯著,表現(xiàn)為曲線變化較陡,當(dāng)其數(shù)值增大或減小時(shí),龍膽多糖提取率有著較大的變化;pH值對(duì)龍膽多糖提取率的影響較小,曲線較為平滑,其數(shù)值的增大或減小對(duì)龍膽多糖提取率的影響較小。

    2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    選擇Design-Expert軟件,結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)考察因素進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳工藝條件為:果膠酶用量4%(以龍膽草質(zhì)量計(jì))、料液比1∶40、提取溫度62.98 ℃、提取時(shí)間5.25 h、pH值1。按優(yōu)化后的最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),龍膽多糖提取率達(dá)到17.69%,與模型預(yù)測值(17.92%)基本一致。

    2.3 龍膽多糖的抗氧化活性

    2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除率

    不同濃度的龍膽多糖溶液和VC對(duì)DPPH自由基的清除率見表4。

    由表4可知,當(dāng)龍膽多糖溶液濃度從0.2 mg·mL-1增加到1.0 mg·mL-1時(shí), DPPH自由基清除率也隨之升高,即清除率與龍膽多糖的濃度存在明顯的量效關(guān)系。但與VC相比,龍膽多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用較弱。

    表4 DPPH自由基清除率測定結(jié)果

    2.3.2 對(duì)羥基自由基的清除率

    不同濃度的龍膽多糖溶液和VC對(duì)羥基自由基的清除率見表5。

    表5 羥基自由基清除率測定結(jié)果

    由表5可知,當(dāng)龍膽多糖溶液濃度從0.2 mg·mL-1增加到1.0 mg·mL-1時(shí),龍膽多糖對(duì)羥基自由基的清除率也隨之升高,且清除率均超過50%,但較相同濃度的VC低。龍膽多糖對(duì)羥基自由基有顯著的清除作用,具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

    3 結(jié)論

    以龍膽多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了龍膽多糖的果膠酶法提取工藝。確定果膠酶法提取龍膽多糖的最佳工藝條件為:果膠酶用量4%(以龍膽草質(zhì)量計(jì))、料液比1∶40 (g∶mL)、提取溫度62.98 ℃、提取時(shí)間5.25 h、pH值1,在此條件下,龍膽多糖提取率達(dá)到17.69%。龍膽多糖具有較好的抗氧化活性,且其抗氧化活性與濃度存在一定的量效關(guān)系。該方法操作簡便、綠色無污染、多糖提取率高,為龍膽多糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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