咳喘寧對RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠的治療作用及對IL-33表達的影響①

孫 樂 羅銀河 王孟清 陳興宇 李 艷 黃凱玲 王潤霞 江智豪 常晨陽

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410000)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，由多種炎癥細胞和細胞組分參與，其特征為反復(fù)發(fā)作，隨病程延長可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄、氣道重塑等病理改變，急性嚴重發(fā)作時可危及生命。呼吸道合胞病毒(respiratory syncy-tial virus,RSV)是臨床常見的下呼吸道感染病原體，可引起RSV相關(guān)性哮喘[1]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的免疫反應(yīng)，IL-33是 IL-1 細胞因子家族成員，在免疫反應(yīng)中具有啟動作用[2-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)哮喘急性發(fā)作患者血清中IL-33明顯增高，且與肺功能相關(guān)指標數(shù)值呈負相關(guān)[5]；此外，IL-33還能促進激素抵抗哮喘兒童肺組織纖維細胞膠原的表達，全程參與RSV誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生發(fā)展過程[6]。但少有關(guān)于IL-33在RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠血清及肺組織中的表達及咳喘寧對IL-33影響的報道。

本實驗構(gòu)建RSV哮喘大鼠模型，經(jīng)咳喘寧干預(yù)后，觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，測定其氣道反應(yīng)性，觀察肺組織病理學(xué)改變，檢測氣道重塑指標和免疫炎癥因子IL-33表達水平，以探究咳喘寧對RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠的治療作用及可能的治療機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級Wistar雌性大鼠60只，28～35 d，體質(zhì)量(100±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SYXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物房。

1.1.2試劑與儀器 RSV Long株、人喉癌上皮細胞 (Hep-2)由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部病毒學(xué)研究所提供；雞卵清白蛋白(OVA)購自北京 Solarbio公司；咳喘寧口服液：炙麻黃、苦杏仁、生石膏、大青葉、黃芪、桃仁、細茶葉、 甘草由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)[(湘)衛(wèi)藥劑(06)05第085號]，100 ml/瓶，含生藥70 g；瑞氏-吉姆薩染液購自北京索寶生物科技有限公司，(貨號：G1040)；蘇木素-伊紅染色液(貨號：P032IH)、中性樹膠(貨號：P033IH)購自Auragene公司；二甲苯(貨號：10023418)、無水乙醇(貨號：10009218)購自國藥公司；IL-33酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(貨號：E20181109012)購自上海晶天生物科技有限公司；TRIzol試劑(貨號：R1022)、DS2000 marker(貨號：M1102)、SYBR Green qRCR Mix(貨號：P2092)購自東盛生物公司；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：K1622)購自Thermo公司；DEPC購自Sigma公司(貨號：V900882)；RT-PCR引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成。S888E 型超聲霧化器購自南京道芬電子有限公司；動物呼吸機、氣道阻力和肺順應(yīng)性軟件分析系統(tǒng)購自美國BUXCO，型號為DHX-50、WBP；YT-6C型生物組織攤烤片機產(chǎn)自湖北孝感；P031IH防脫載玻片購自BurBgene公司；BE41光學(xué)顯微鏡購自Motic公司；MK3型酶標儀購自Thermo公司；16K-R型低溫臺式離心機購自長沙鑫奧儀器公司；722S型分光光度儀購自上海第三分析儀器廠；7300熒光定量PCR儀購自ABI公司；THERM-1000型PCR儀購自Corning公司；DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠公司。

1.2方法

1.2.1建立RSV誘導(dǎo)哮喘大鼠模型 大鼠正常適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機選擇15只作為正常組,余下45只參照文獻[7]制作模型，實驗第1、2天分別滴鼻1.0×106PFU RSV，50 μl/只，同時腹腔注射1%OVA 致敏，0.25 ml/只，正常組給予等體積 Hep-2 滴鼻，腹腔注射生理鹽水0.25 ml/只。處理后正常喂養(yǎng)一周，實驗第9天起，造模大鼠霧化吸入1%OVA激發(fā)哮喘，正常組使用等量生理鹽水霧化，隔天1次，30 min/次，共14 d，霧化激發(fā)階段可觀察到造模大鼠煩躁不安、呼吸急促、頻繁撓鼻、大小便失禁等。實驗第15天，正常組和造模后大鼠各取5只進行氣道反應(yīng)性測定，經(jīng)乙酰膽堿(Ach)激發(fā)后，造模后大鼠的肺阻力(RI)明顯高于正常組(P<0.05)，表明造模成功,如圖1。

圖1 氣道反應(yīng)性檢測示造模成功

1.2.2氣道高反應(yīng)性測定 給藥前隨機取正常組和模型組大鼠各5只，給藥14 d后各組所有大鼠均進行氣道反應(yīng)性測定。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.3 ml/100 g。將大鼠固定于鼠板，暴露氣管和頸靜脈，用靜脈留置針行頸靜脈穿刺并固定；V形剪開氣管，使用深靜脈穿刺針改造的氣管導(dǎo)管行氣管插管后連接動物呼吸機，設(shè)置呼吸頻率為75 次/min，吸呼比1∶1，潮氣量8 ml/kg。經(jīng)頸靜脈依次間歇推注生理鹽水、6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml的Ach 0.5 ml，每次間隔約1 min，計算機動物肺功能分析軟件檢測氣道阻力(RL)和用藥后的RL，以RL超過基礎(chǔ)值的2倍以上為停止Ach推注標準，以RL變化代表氣道反應(yīng)性。

1.2.3分組及給藥 造模成功的大鼠隨機分為模型組、咳喘寧高劑量組、咳喘寧中劑量組和咳喘寧低劑量組，每組10只。正常飼養(yǎng)1周。按臨床量效關(guān)系觀察結(jié)果擬定低、中、高劑量組咳喘寧口服液灌胃濃度分別為0.033 ml/100 g、0.3 ml/100 g和1 ml/100 g，正常組和模型組均灌胃等劑量的生理鹽水。實驗第29天開始給藥，每天1次，共14 d。

1.2.4行為學(xué)觀察 給藥期間每日觀察各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，記錄有無哮喘急性發(fā)作，給藥第14天記錄單位時間(1 min)內(nèi)各組大鼠撓鼻和打噴嚏次數(shù)以評價咳喘寧藥物組大鼠哮喘病情有無改善。

1.2.5HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變 將大鼠肺組織浸入4 %多聚甲醛固定24 h，經(jīng)乙醇脫水后，置于60℃蠟盒內(nèi)浸蠟、包埋、切片，分別于蘇木素和伊紅染液中染色，脫水，中性樹膠固定，封片。將制作好的切片置于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.6Masson染色觀察支氣管上皮細胞下膠原沉積 取大鼠肺組織，于氣管內(nèi)注射 4 %多聚甲醛1 ml 后將全肺浸入 4 %多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋、切片,進行Masson′s Trichrome 染色，中性樹膠固封。光鏡下觀察支氣管上皮細胞下膠原沉積情況，其中陽性區(qū)域為藍色。

1.2.7ELISA檢測血清IL-33水平 最后一次給藥后經(jīng)腹主動脈采血，室溫下靜置20 min，2 500 r/min離心20 min，獲取血清，ELISA試劑盒檢測血清中IL-33水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。酶標比色儀測定各反應(yīng)孔OD值(于波長450nm處，標準孔調(diào)零)，參照試劑盒提供的標準品繪制曲線并計算血清中IL-33濃度。

1.2.8qPCR 檢測IL-33 mRNA水平 TRIzol 法提取肺組織總RNA，取少量測定RNA純度及完整性，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后立即進行qRCR定量，設(shè)置20 μl反應(yīng)體系，IL-33上游引物5′-GAAGAGATCCCTGCTTGGCA-3′，下游引物5′-TCCACACCGTCTCCTGATTG-3′。步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。反應(yīng)參數(shù)：95℃，3 min；95℃，10 s；60℃，30 s，共40個循環(huán)。參照說明書計算擴增效率，確認各目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率是否一致(接近100%且差距<5%)。使用2-ΔΔCt法行分析基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1咳喘寧對哮喘大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響 正常組大鼠精神良好，活動敏捷，呼吸頻率正常；模型組大鼠精神萎靡，蜷縮成團，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，皮毛枯糙，實驗期間常有撓鼻、打噴嚏等癥狀，多次哮喘急性發(fā)作，呼吸急促。與模型組相比，咳喘寧組精神狀態(tài)較好，對一般刺激較為敏感，蜷縮成團行為少見，偶有哮喘急性發(fā)作，撓鼻、打噴嚏癥狀減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中咳喘寧高劑量組與模型組的差異最為明顯(P<0.05)。單位時間內(nèi)(1 min)各組大鼠撓鼻、打噴嚏次數(shù)見表1。

表1 各組大鼠單位時間內(nèi)撓鼻、打噴嚏次數(shù)(次，

2.2咳喘寧對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)改變的影響 正常組大鼠肺組織和支氣管結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無明顯增厚，無充血，肺間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肺組織和支氣管結(jié)構(gòu)不完整甚至消失，肺泡壁增厚，支氣管黏膜和血管壁充血明顯，炎癥細胞大量浸潤。與模型組相比，咳喘寧高、中、低劑量組織破壞程度有明顯改善，肺泡壁輕度增厚，支氣管腔無明顯縮窄，較少炎癥細胞浸潤，其中咳喘寧高劑量組的破壞最輕，仍留存完整的肺泡結(jié)構(gòu)，支氣管平滑肌皺襞不明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化(×200)

2.3咳喘寧對哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性的影響 在不同濃度的Ach激發(fā)下，模型組的氣道阻力明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；咳喘寧藥物組的氣道阻力均低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度Ach激發(fā)下各組大鼠的氣道反應(yīng)性

2.4咳喘寧對哮喘大鼠氣道上皮細胞下膠原沉積的影響 Masson染色結(jié)果見圖3，正常組大鼠氣道上皮細胞下膠原沉積極少；模型組氣道上皮細胞下大量膠原沉積，肺組織破壞嚴重，深度藍染； 與模型組相比，咳喘寧低劑量組藍染相對較淺，但仍有較多膠原沉積，咳喘寧中、高劑量組膠原沉積明顯減少，高劑量組改善效果最好。

圖3 各組大鼠Masson染色結(jié)果(×200)

2.5咳喘寧對哮喘大鼠血清IL-33和肺組織IL-33 mRNA的表達影響 ELISA和qPCR結(jié)果見表3和表4，其中正常組血清IL-33和肺組織IL-33 mRNA表達最低，模型組IL-33表達顯著升高(P<0.05)，與之相比，咳喘寧干預(yù)后大鼠體內(nèi)IL-33表達水平下調(diào)，其中以咳喘寧高劑量組的下降最為顯著(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清IL-33水平

表4 各組大鼠肺組織IL-33 mRNA表達水平

3 討論

支氣管哮喘是嚴重威脅人類健康的世界性疾病，急性發(fā)作未得到及時治療可迅速致死，危害極大。但其發(fā)病機制尚不完全明確，臨床使用的藥物療效有限，因此，探究哮喘的發(fā)病機制和尋找有效的新藥具有重要意義。RSV是一種分布廣泛、傳染性較強的 RNA 病毒，流行病學(xué)資料顯示，反復(fù)RSV感染可增加嬰幼兒日后患哮喘的風(fēng)險[8]。病毒感染引起的哮喘與炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)，有研究表明呼吸道合胞病毒感染誘導(dǎo) BALB/c 鼠肺組織巨噬細胞及樹突狀細胞中IL-33 mRNA高表達可增強由RSV 感染引發(fā)的炎癥應(yīng)答[9]。IL-33屬于白介素1家族，主要表達于上皮細胞和內(nèi)皮細胞，可能是一種在細胞受損時向免疫系統(tǒng)發(fā)出危險信號的警報[10]。正常情況下，IL-33并不具有促炎作用，當(dāng)細胞損傷或壞死時，成熟的IL-3395～ 270、IL-3399～270和IL-33109～270釋放到細胞外，與選擇性表達在 Th2 細胞表面的ST2(suppression of tumorigenicity 2)受體結(jié)合激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)Th2細胞分泌效應(yīng)因子，促進炎癥反應(yīng)[11]。同時有研究顯示,抗IL-33可降低疾病各階段的2型炎癥，反向證實了IL-33的促炎作用[12]。IL-33也參與氣道重塑的發(fā)生，Guo等[13]對哮喘患者氣道黏膜活檢組織進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)受損的氣道上皮細胞和間質(zhì)成纖維細胞高度表達IL-33，HE染色觀察到上皮下纖維化嚴重，基底膜明顯增厚，且增高的 IL-33 水平與基底膜厚度呈正相關(guān)。此外，IL-33 抗體可減少哮喘模型小鼠中 α-SMA 與 Col1 的蛋白表達，緩解哮喘小鼠氣道重塑，因此推測IL-33可能通過上調(diào)α-SMA 與 Col1 蛋白表達誘導(dǎo)氣道重塑[14]。本研究中，與正常組相比，模型組大鼠HE染色病理學(xué)顯示肺組織破壞明顯，Masson染色中支氣管上皮細胞下膠原沉積增多，血清IL-33和肺組織IL-33 mRNA表達顯著升高，IL-33表達水平增高與大鼠肺組織、氣道病理改變嚴重程度的趨勢呈正相關(guān)，與已有研究結(jié)果相同。

中醫(yī)藥治療哮喘療效確切，且副作用少，在哮喘防治方面具有獨特優(yōu)勢[15]?？却瓕幱砂l(fā)散表邪的代表方劑五虎湯另加黃芪、大青葉、桃仁三味藥組成，用于治療喘息性疾病。臨床研究和動物實驗均證明咳喘寧治療RSV誘發(fā)哮喘療效顯著，且其治療作用與哮喘發(fā)生發(fā)展的免疫機制相關(guān)[16]。方中麻黃含麻黃堿，可有效舒張支氣管，具有抗炎、抗過敏的作用；苦杏仁能平喘止咳；石膏清瀉肺熱；大青葉具有抗炎抗病毒作用；黃芪扶正祛邪，可增強人體免疫力，抑制病毒；桃仁活血化瘀，緩解炎癥反應(yīng)；細茶葉清神化痰；甘草鎮(zhèn)咳平喘，具有抗炎抗過敏作用。

本研究中，與模型組相比，咳喘寧高、中、低劑量組大鼠的哮喘癥狀、氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑都有不同程度的改善，且高劑量組的治療作用最為顯著，說明咳喘寧對哮喘癥狀緩解的有效性。ELISA法和qPCR分別從蛋白和基因水平檢測IL-33表達，模型組較正常組表達水平顯著升高，說明IL-33參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)氣道重塑；經(jīng)咳喘寧治療后，與模型組相比，大鼠血清中IL-33濃度和肺組織IL-33 mRNA表達均下降，其中高劑量組下降最明顯，表明咳喘寧能有效下調(diào)血清中及肺組織中IL-33的表達，減少Th2細胞分泌效應(yīng)因子，減輕免疫炎癥反應(yīng)對氣道上皮細胞和肺內(nèi)皮細胞損傷；減少氣道和肺組織纖維細胞膠原表達，抑制氣道重塑?？梢娧迮c肺組織IL-33的表達變化在一定程度上可提示哮喘的病情變化，反映治療效果。

綜上所述，IL-33與哮喘氣道免疫炎癥反應(yīng)和氣道重塑的發(fā)生關(guān)系密切，在哮喘的診治中，IL-33的表達可為判斷哮喘病情進展及藥物療效提供重要依據(jù)。因此推測，IL-33很可能是治療RSV誘導(dǎo)哮喘的重要靶點，咳喘寧對RSV誘導(dǎo)哮喘的治療作用可能是通過下調(diào)IL-33的表達實現(xiàn)的。