丙泊酚通過上調(diào)miR-204對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響①

崔 鵬 胡 杰 王曉飛 夏玉中 阮孝國 蔡 明 (鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院麻醉科,鄭州 471000)

乳腺癌是臨床上最為常見的婦科腫瘤，是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的女性死亡的首要原因之一。由于發(fā)展中國家對早期診斷的忽視，乳腺癌患者的生存率遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家，5年生存率不到40%[1]。外科手術(shù)切除治療是現(xiàn)今治療乳腺癌的一線方案，局部或轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)是導(dǎo)致術(shù)后患者死亡的主要原因之一，在手術(shù)期間往往會導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞免疫抑制，加速腫瘤生長及擴(kuò)散，而麻醉藥的選擇對緩解腫瘤的手術(shù)治療中的應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要[2,3]。丙泊酚是一種臨床上廣泛使用的短效靜脈麻醉藥，大量研究表明其在腫瘤治療過程中發(fā)揮腫瘤抑制作用，然而其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步明確[4]。本研究培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，并通過丙泊酚和miR-204 inhibitor處理，探究了丙泊酚對miR-204的影響及其對乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司；Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher公司；丙泊酚購自Sigma公司，miR-204 mimic、miR-204 inhibitor、陰性對照mimic(mimic NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；所有引物由上海生工生物工程有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒購自Bio-Rad公司；TRIzol試劑、RIPA試劑購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；熒光素酶報告系統(tǒng)購自Promega公司；GAPDH抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)一抗，HRP酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司。

1.1.2細(xì)胞來源 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自中科院上海細(xì)胞庫，采用含100 U/ml青霉素、100 μg/ml 鏈霉素，10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞株在37℃，5%CO2的環(huán)境條件下生長。

1.2方法

1.2.1分組及處理方法 MDA-MB-231細(xì)胞分為對照(Control)組，Propofol組，miR-204 inhibitor組和Propofol+miR-204 inhibitor組，其中Control組正常培養(yǎng)48 h；Propofol組在轉(zhuǎn)染mimic NC 24 h后換液采用5 μg/ml的丙泊酚處理24 h；miR-204 inhibitor組在轉(zhuǎn)染miR-204 inhibitor 24 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Propofol+miR-204 inhibitor組按照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染miR-204 inhibitor 24 h后，換液再經(jīng)過5 μg/ml的丙泊酚進(jìn)行處理24 h。收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2RT-PCR檢測mRNA及miRNA水平 TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒說明配制反應(yīng)體系檢測各組RNA水平，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)，2-ΔΔCt法處理實驗結(jié)果。

1.2.3Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 向Transwell小室中加入50 μl基質(zhì)膠，并于37℃條件下凝固，向小室上室中加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，下室中加入完全培養(yǎng)液，將細(xì)胞接種于上室，常規(guī)環(huán)境條件下培養(yǎng)48 h。洗掉未通過基質(zhì)膠的細(xì)胞，多聚甲醛固定剩余細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色15～20 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞透過情況，平均每個小室取6個視野進(jìn)行計數(shù)，取平均值評價細(xì)胞侵襲能力。

1.2.4劃痕愈合法檢測細(xì)胞遷移 將細(xì)胞接種于6孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿板內(nèi)80%的空間后，使用中槍頭對細(xì)胞劃線，PBS緩沖液清洗剝落的細(xì)胞殘渣，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡拍照，使用Image proPlus軟件分析0 h和24 h細(xì)胞劃痕邊界距離，0 h距離減去24 h距離既得24 h細(xì)胞遷移距離。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達(dá) RIPA試劑提取樣品總蛋白，定量后以30 μg/孔上樣，10%SDS-PAGE電泳分離各組蛋白，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，兔一抗4℃孵育過夜后TBST緩沖液漂洗，加入HRP酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h后ECL顯色。

1.2.6熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miRNA靶向作用 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan預(yù)測miR-204和MMP-9的靶向作用位點，構(gòu)建psi-MMP-9 3′UTR載體，并根據(jù)Lipofectamine 2000說明書與miR-204 mimic同時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1丙泊酚提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞中miR-204的表達(dá) 如圖1A所示，與Control組相比，Propofol(2、5、10)μg/ml組MDA-MB-231細(xì)胞中miR-204表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；后續(xù)實驗以5 μg/ml濃度進(jìn)行，如圖1B所示，與Control組相比，Propofol組MDA-MB-231細(xì)胞中miR-204表達(dá)顯著升高，miR-204 inhibitor組miR-204表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Propofol組相比，Propofol+miR-204 inhibitor組miR-204表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 RT-PCR檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中miR-204表達(dá)

2.2丙泊酚抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲 如圖2所示，與Control組相比，Propofol組MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少，miR-204 inhibitor組的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Propofol組相比，Propofol+miR-204 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 Transwell檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力

2.3丙泊酚抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移 如圖3所示，與Control組相比，Propofol組MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕愈合率顯著降低，miR-204 inhibitor組劃痕愈合率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Propofol組相比，Propofol+miR-204inhibitor組劃痕愈合率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 劃痕愈合法檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移能力

2.4丙泊酚抑制MDA-MB-231細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 如圖4所示，與Control組相比，Propofol組MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低，miR-204 inhibitor組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Propofol組相比，Propofol+miR-204 inhibitor組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)

2.5丙泊酚抑制MMP-9在MDA-MB-231細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄 如圖5所示，與Control組相比，Propofol組MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9基因轉(zhuǎn)錄顯著降低，miR-204 inhibitor組MMP-9基因轉(zhuǎn)錄顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Propofol組相比，Propofol+miR-204 inhibitor組中MMP-9基因轉(zhuǎn)錄顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 RT-PCR法檢測MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄

2.6丙泊酚抑制MMP-9在MDA-MB-231細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 如圖6所示，與Control組相比，Propofol組MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，miR-204 inhibitor組MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Propofol組相比，Propofol+miR-204 inhibitor組中MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 蛋白印跡法檢測MMP-9的蛋白表達(dá)

2.7miR-204靶向作用于MMP-9 如圖7所示，與WT MMP-9+mimic NC比較，WT MMP-9+miR-204 mimic中熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，MUT MMP-9+mimic NC和MUT MMP-9+miR-204 mimic比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖7 熒光素酶報告實驗檢測miR-204和MMP-9靶向作用關(guān)系

3 討論

丙泊酚是一種常見的靜脈麻醉藥，大量證據(jù)表明丙泊酚可通過直接或間接的方式影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。調(diào)控miRNA表達(dá)是丙泊酚發(fā)揮抑癌作用的重要機(jī)制之一。研究表明丙泊酚可通過調(diào)控miR-24、miR-9、miR-34a-5p等miRNA對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)揮調(diào)控作用，而丙泊酚對miR-204是否具有調(diào)控作用還未見報道，盡管兩者都可以通過調(diào)控MMP-9發(fā)揮抑癌作用[5-9]。本研究檢測了不同濃度丙泊酚處理條件下乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中miR-204的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)丙泊酚可濃度依賴性地上調(diào)miR-204表達(dá)，表明丙泊酚對乳腺癌細(xì)胞miR-204的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

腫瘤細(xì)胞具有易轉(zhuǎn)移的特征，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移最重要的機(jī)制。EMT可使腫瘤細(xì)胞外圍基質(zhì)降解，使細(xì)胞和基質(zhì)間的黏附作用丟失，從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)入侵到其他組織和器官形成轉(zhuǎn)移灶[10,11]。研究表明，丙泊酚對乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有顯著的抑制作用[8,12]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲和遷移，并上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)N-cadherin和Vimentin表達(dá)。E-cadherin在上皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間接觸、細(xì)胞極性、細(xì)胞外基質(zhì)和骨架的維持等方面具有重要作用，N-cadherin則在成纖維細(xì)胞形態(tài)、提高細(xì)胞運動和侵襲作用上起重要作用，E-cadherin的丟失和N-cadherin的上調(diào)是EMT過程中的關(guān)鍵事件，Vimentin是一種細(xì)胞骨架的關(guān)鍵蛋白，具有調(diào)控微管、肌動蛋白、黏著斑和遷移細(xì)胞間的黏著連接的作用，在EMT過程中起重要作用，三者都常用作檢測細(xì)胞EMT的標(biāo)志物[13-17]。此外，通過miR-204 inhibitor處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-204表達(dá)下調(diào)，可顯著逆轉(zhuǎn)丙泊酚對細(xì)胞侵襲、遷移及EMT的抑制作用。結(jié)合上述結(jié)果表明，丙泊酚可通過上調(diào)miR-204抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移及EMT。

細(xì)胞外基質(zhì)的降解在乳腺癌增殖、侵襲遷移等過程中起重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族是一類分解細(xì)胞外基質(zhì)的Zn-蛋白水解酶類，其中MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶之一[18,19]，乳腺癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)患者腫瘤組織中MMP-9的陽性表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[20]。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可濃度依賴性地下調(diào)MMP-9的表達(dá)；而Luan等[9]研究則表明惡性黑色素瘤中的miR-204可通過靶向下調(diào)MMP-9表達(dá)發(fā)揮腫瘤抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可顯著降低MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致。本研究通過miR-204 inhibitor下調(diào)miR-204表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-204下調(diào)可恢復(fù)MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，熒光素酶報告基因?qū)嶒炓脖砻鱩iR-204可靶向作用于MMP-9，提示丙泊酚可通過上調(diào)miR-204靶向抑制MMP-9表達(dá)。

綜上所述，丙泊酚可上調(diào)miR-204表達(dá)，而miR-204可通過靶向作用于MMP-9抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移及EMT。本研究為丙泊酚治療癌癥的作用機(jī)制提供了新的理解，為丙泊酚的臨床應(yīng)用提供了新的參考。