基于TGF-β2/Smad2信號(hào)通路探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

劉遠(yuǎn)靈 曾昭昌 張建軍 (廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,廣州 510000)

膀胱癌(bladder cancer，BC)作為臨床最常見(jiàn)的尿路系統(tǒng)腫瘤之一，具有發(fā)病迅速，轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)，男性發(fā)病率高于女性[1]。BC早期癥狀不明顯，患者在就診時(shí)往往已經(jīng)處于晚期，目前治療BC的主要手段是手術(shù)及術(shù)后化療藥物灌注，但仍有50%以上的患者復(fù)發(fā)[2]。研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化( epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是癌癥轉(zhuǎn)移的主要因素，也是治療失敗的重要原因，因此尋找新的治療靶點(diǎn)尤為迫切[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，lncRNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子，長(zhǎng)度介于200～100 000 nt之間[4]。研究表明，lncRNA在腫瘤細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移與化療耐藥等相關(guān)信號(hào)通路中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因[5]。作為lncRNA 家族成員之一，lncRNA NEAT1已被證實(shí)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮分化調(diào)控的作用，且在多種腫瘤中異常表達(dá)[6]。BC的發(fā)生發(fā)展及EMT過(guò)程中有諸多非編碼RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的參與，但目前鮮有關(guān)于lncRNA NEAT1在BC中的作用研究。因此，本研究通過(guò)對(duì)BC組織和細(xì)胞株的研究，探討lncRNA NEAT1對(duì)BC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT的影響及其可能的作用機(jī)制，為臨床治療BC提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1組織標(biāo)本 收集2015年3月～2018年5月于我院接受手術(shù)治療的143例BC患者癌組織及距離癌組織超過(guò)2cm處的正常組織，用以上組織構(gòu)建BC組織芯片。在經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后有15例組織標(biāo)本出現(xiàn)不同程度的缺失，其余128例標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)為原發(fā)性BC，并納入研究。其中男性患者85例，女性患者43例，年齡38～78歲，平均年齡(55.28±6.76)歲，組織學(xué)分型：高分化患者25例，中分化患者56例，低分化患者47例，術(shù)前患者均未進(jìn)行放化療。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2細(xì)胞來(lái)源 人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1、人源BC細(xì)胞株T24、5637、SCaBER、J82、UM-UC-3均購(gòu)自上海博古生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器與試劑 siNEAT1及陰性對(duì)照物NC、lncRNA NEAT1及U6引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成。DMEM培養(yǎng)基(D777)、SYBR Green 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒(QPK-201)購(gòu)自TOYOBO；TRIzol reagent(9009)購(gòu)自TaKaRa；免疫熒光試劑盒、Transwell小室采購(gòu)自BD；E-cadherin、Vimentin、TGF-β2、Smad2一抗、二抗均購(gòu)自北洋百川生物技術(shù)有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor594-偶聯(lián)二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)；三洋 MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱；尼康 Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；艾本德5810R 型高速離心機(jī)；羅氏 R480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；蔡司LSM710共聚焦激光掃描顯微鏡。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 調(diào)整BC T24細(xì)胞株濃度至1×106個(gè)/ml，取2 ml接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，采用Lipofectamine 2000將濃度為100 nmol/L的siNEAT1和NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，以不轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞為空白對(duì)照，得到T24-siNEAT1及T24-NC細(xì)胞株。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)lncRNA NEAT1表達(dá) TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，并按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 10s，60℃ 30 s，72℃ 10s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30s。PCR引物序列：U6(F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，lncRNA NEAT1(F：5′-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)，miR-200a-3p(F：5′-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，R：5′-GTGCAGGG-TCCGAGGT-3′)，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.2.3MTT及平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將T24、T24-NC及T24-siNEAT1細(xì)胞按照500～1 000個(gè)/孔鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加20 μl MTT溶液，37℃避光4 h 后，棄掉孔內(nèi)液體，各加入100 μl DMSO，37℃搖床快速振蕩15 min充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm 處的OD值。將上述兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞以5 000個(gè)/孔鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍(lán)染色，記錄菌落形成數(shù)量。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 實(shí)驗(yàn)前12 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，將40 μl matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室消化細(xì)胞，并用1×PBS清洗2遍，將500 μl 完全培養(yǎng)基加入24 孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×105個(gè)細(xì)胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl 細(xì)胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無(wú)氣泡，置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng) 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1 %結(jié)晶紫染液500 μl染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，倒置熒光顯微鏡觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和Vimentin表達(dá) 細(xì)胞接種于玻片上，培養(yǎng)固定，4℃孵育過(guò)夜，用E-cadherin或Vimentin抗體進(jìn)行免疫熒光分析(1∶1 000)。乙醇梯度洗脫后，室溫下用Alexa Fluor 594-偶聯(lián)二抗(1∶5 000)孵育1 h，DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase預(yù)測(cè)可與NEAT1互補(bǔ)結(jié)合的miRNA，根據(jù)Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)相應(yīng)miRNA可靶向結(jié)合的基因。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 向培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水浴變性5 min，加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)，25 μl/孔上樣，調(diào)整濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入相應(yīng)一抗，4℃過(guò)夜，TBST沖洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h后加入ECL顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1lncRNA NEAT1在BC組織、癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，BC組織中NEAT1表達(dá)水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NEAT1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在T24細(xì)胞中表達(dá)量最高(P<0.01)，適合使用RNA干擾的方法進(jìn)行后續(xù)NEAT1基因功能的研究，見(jiàn)圖1。

圖1 lncRNA NEAT1在BC組織和不同BC細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2細(xì)胞系構(gòu)建 qRT-PCR結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與T24-NC組NEAT1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T24-siNEAT1組細(xì)胞中NEAT1表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和T24-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示成功構(gòu)建NEAT1沉默細(xì)胞系，見(jiàn)圖2。

圖2 lncRNA NEAT1在各組T24細(xì)胞中的表達(dá)

2.3NEAT1對(duì)BC細(xì)胞株T24增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染2周后T24-siNEAT1組細(xì)胞中NETA1表達(dá)與空白對(duì)照組和T24-NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和T24-NC組相比，NEAT1被沉默后，T24-siNEAT1組OD492值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默NEAT1后，T24-siNEAT1細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少(P<0.05)。提示NEAT1被沉默后，細(xì)胞增殖能力顯著降低，見(jiàn)圖3。

圖3 lncRNA NEAT1對(duì)各組T24細(xì)胞增殖能力的影響

2.4lncRNA NEAT1對(duì)BC細(xì)胞株T24侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組和T24-NC組相比，沉默NEAT1后，T24-siNEAT1細(xì)胞通過(guò)matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明沉默NEAT1后，細(xì)胞侵襲能力明顯降低(圖4)。

圖4 lncRNA NEAT1對(duì)各組T24細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5lncRNA NEAT1對(duì)EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示， 與空白對(duì)照組和T24-NC組相比，T24-siNEAT1組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯升高，Vimentin表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin和Vimentin在免疫熒光中呈現(xiàn)紅色，結(jié)果顯示，T24-siNEAT1組細(xì)胞中E-cadh-erin明顯增多，Vimentin明顯降低。提示沉默NEAT1影響細(xì)胞EMT，見(jiàn)圖5。

圖5 lncRNA NEAT1對(duì)E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

2.6生物信息學(xué)預(yù)測(cè) starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NEAT1可與miR-200a-3p互補(bǔ)結(jié)合(圖6A)，Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析顯示，miR-200a-3p與TGF-β2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖6B)。

圖6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA NEAT1與TGF-β2的關(guān)系

2.7lncRNA NEAT1與TGF-β2/Smad2的作用關(guān)系 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示T24-siNE-AT1組中miR-200a-3、TGF-β2及p-Smad2表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組與T24-NC組(P<0.05)，空白對(duì)照組和T24-NC組中上述指標(biāo)的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示NEAT1對(duì)TGF-β2/Smad2通路蛋白表達(dá)具有促進(jìn)作用，見(jiàn)圖7。

圖7 lncRNA NEAT1與TGF-β2/Smad2的作用關(guān)系

3 討論

膀胱尿路上皮細(xì)胞癌因發(fā)病位置比較隱蔽，不易檢查，且早期癥狀復(fù)雜，缺少明顯特征，常導(dǎo)致診斷和治療延誤[7]。因此從分子生物學(xué)角度出發(fā)尋找其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，對(duì)于患者選擇合適的治療方法及預(yù)后指標(biāo)的判定具有重要意義。

有研究表明，一些lncRNA在腫瘤中異常表達(dá)，功能類似于癌基因或抑癌基因，其可通過(guò)參與調(diào)控細(xì)胞周期影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。尚無(wú)標(biāo)志性lncRNA可以直接預(yù)測(cè)BC。目前已經(jīng)證實(shí)lncRNA NEAT1在多種癌癥中特異性表達(dá)[9]。Qi等[10]采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NEAT1在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。Zheng等[11]研究表明在胰腺癌患者癌組織和血清中，NEAT1表達(dá)量上調(diào)。NEAT1在胰腺癌細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)量顯著升高，而被沉默后，胰腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，且與增殖相關(guān)的基因表達(dá)亦降低，推測(cè)lncRNA NEAT1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖[12]。本研究采用qRT-PCR檢測(cè)lncRNA NEAT1在BC組織、癌旁組織及不同細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在BC組織和癌細(xì)胞中其表達(dá)水平明顯高于癌旁組織及正常細(xì)胞，提示NEAT1可能在BC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步研究lncRNA NEAT1在BC中的作用，本研究在構(gòu)建了NEAT1沉默細(xì)胞系的基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1下調(diào)后，BC細(xì)胞T24的侵襲能力和遷移能力明顯降低。

EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)行為，在胚胎形成、器官發(fā)育、組織再生和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。在腫瘤進(jìn)展中，分別代表上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物E-cadherin和Vimentin的異常表達(dá)可以反映出腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、藥物敏感性及抗凋亡能力的變化[13]。 NEAT1在乳腺癌中表達(dá)明顯高于癌旁組織，對(duì)腫瘤的遷移和EMT起到促進(jìn)作用[14]。本研究顯示，與對(duì)照組相比，T24-siNEAT1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)明顯升高，Vimentin表達(dá)明顯降低。提示NEAT1可能通過(guò)促進(jìn)BC T24細(xì)胞的EMT過(guò)程提高細(xì)胞的遷移能力。

研究表明，miRNA是通過(guò)堿基不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合于靶基因，從而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷徙與轉(zhuǎn)移，并引發(fā)周圍細(xì)胞的壞死與凋亡[15]。同時(shí)，miRNA也是lncRNA發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)。本研究應(yīng)用starBase數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)NEAT1可與miR-200a-3p互補(bǔ)結(jié)合。Sharp等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a-3p在食管癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及EMT，miR-200a-3p作為癌基因?qū)κ彻馨┑倪M(jìn)展發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究中，T24細(xì)胞NEAT1沉默后，miR-200a-3p下降。提示NEAT1對(duì)BC細(xì)胞株T24的增殖及EMT的促進(jìn)作用可能與miR-200a-3p上調(diào)有關(guān)。Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，miR-200a-3p可互補(bǔ)結(jié)合TGF-β2，進(jìn)一步分析顯示，miR-200a-3p表達(dá)下調(diào)后，TGF-β2蛋白表達(dá)降低。TGF-β2/smad2 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，該通路通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Smad 蛋白實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)通路信號(hào)的傳導(dǎo)[17]。Smad 蛋白包括 Smad1-Smad9，其中當(dāng) Smad2磷酸化水平升高時(shí)，TGF-β2/Smad2信號(hào)通路的生物學(xué)功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲起促進(jìn)作用[18]。這可能是由于Smad2蛋白通過(guò)與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的E-box結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT和細(xì)胞侵襲[19]。本研究發(fā)現(xiàn)T24-siNEAT1組細(xì)胞中Smad2磷酸化水平明顯降低。 既往研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NEAT1表達(dá)后，TGF-β2蛋白表達(dá)降低，從而抑制結(jié)直腸癌的侵襲與遷移[20]。提示NEAT1可能通過(guò)調(diào)節(jié) TGF-β2/smad2 信號(hào)通路抑制細(xì)胞EMT過(guò)程，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，lncRNA NEAT1在膀胱癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，高表達(dá)的NEAT1可能通過(guò)上調(diào)miR-200a-3p，調(diào)控TGF-β2/Smad2信號(hào)通路，促進(jìn)EMT過(guò)程，從而影響B(tài)C的發(fā)展。