谷紅注射液促進骨折大鼠模型骨愈合作用研究①

陳朝祥 周淑平 王鄭鋼 張 衛(wèi) 向 亮 侯 威 伍俊星

(南華大學附屬南華醫(yī)院關節(jié)運動科，衡陽 421002)

骨折愈合是一個極其復雜的組織學和生物化學變化過程。研究顯示，臨床約有5%～10% 患者出現(xiàn)骨折愈合延遲，需進一步手術治療，給患者及其家庭帶來負擔[1,2]。谷紅注射液為中西藥復方制劑，其主要成分為紅花提取物及乙酰谷酰胺。其中乙酰谷酰胺是谷氨酰胺乙酰化的衍生物，屬于一種神經(jīng)肽，作為臨床上廣泛應用的腦功能改善輔助劑，已得到一系列臨床試驗的證實[3,4]；而紅花主要功效為祛瘀止痛、活血通經(jīng)，對跌打損傷以及關節(jié)疼痛等癥狀治療效果顯著，目前關于谷紅注射液對大鼠骨折愈合作用研究較少。本研究通過制備骨折大鼠模型，觀察谷紅注射液對其骨礦物質密度(BMD)、血清堿性磷酸酶(ALP)、成纖維細胞生長因子2(FGF-2)等的影響，為初步確定和評判谷紅注射液促進骨折愈合的作用提供藥理實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取清潔級SD 大鼠72只，雄性，8～10周齡，體質量(200±20)g，許可證號：SCXK(湘) 2013-0005，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。本研究通過南華大學附屬南華醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2試藥與儀器 谷紅注射液(通化谷紅制藥有限公司)；復方骨肽注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，批號 170522)；FGF-2免疫組化試劑盒 (美國 HyClone-PIERCE公司)；ALP檢測試劑盒(德國 Roche Diagnostics GmbH)；FGF-2試劑盒(ELISA，上海撫生實業(yè)有限公司)；X線骨密度儀和ELISA 酶標儀(德國Roche 公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠骨折模型制作 大鼠采用10%水合氯醛麻醉，右側小腿脛骨常規(guī)消毒后切開約2 cm，向外分離皮膚，然后在脛骨結節(jié)下1 cm截斷脛骨，制造橫行骨折，髓內采用0.8 mm醫(yī)用配藥針頭固定骨折斷段，關閉切口。

1.2.2分組與給藥 造模成功后，將SD大鼠隨機分為對照組(生理鹽水灌胃)、谷紅注射液組[谷紅注射液，10 ml/(kg·d)腹腔注射]，陽性藥組[復方骨肽注射液，5 ml/(kg·d)腹腔注射]，每組24只。

1.2.3影像學檢查 分別于建模后第2、4、6周各組隨機選取8只大鼠，脫頸法處死大鼠，采用X線機觀察骨折情況。影像學條件：柯達底片，大鼠后肢距膠片距離25 cm，曝光時間1.25 s，放大倍率約33%，進行X線掃描拍片。骨折愈合評分采用Garrett等骨折愈合影像學標準[5]。

1.2.4BMD檢測 影像學檢查后切開大鼠骨折處皮膚暴露脛骨，斷離右下肢保留脛骨全長，拔除髓內針，將脛骨周圍軟組織剝離，注意保護骨折端愈合的骨痂組織，防止骨折端分離，進行離體BMD測量。

1.2.5HE染色 大鼠在不同時段分批進行BMD 檢測后，將右側脛骨于4%多聚甲醛中固定，PBS沖洗后轉入乙醇固定，進行骨組織脫鈣，大鼠脛骨置于脫鈣液中脫鈣3周。脫鈣完成后用蒸餾水沖洗兩遍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，干燥后進行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6ALP及FGF-2檢測 造模后第2、4、6周時，各組隨機選取8只大鼠進行尾靜脈取血，離心5 min，室溫放置，8 h內完成血清ALP濃度檢測。檢測采用日立7600全自動生化儀檢測，所有實驗均按說明書進行操作；同時，采用ELISA法對血清中FGF-2進行檢測，嚴格按照說明書進行操作，記錄酶標儀OD值。

1.2.7免疫組化檢測 造模后第2、4、6周時，各組隨機選取8只大鼠，脫頸法處死大鼠，取右側脛骨，進行骨組織脫鈣，大鼠脛骨置于脫鈣液中脫鈣3周。脫鈣完成后用蒸餾水沖洗，酒精梯度脫水，透明12 h，骨組織包埋切片，干燥后進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察，使用 Image J 圖像分析軟件對所有視野進行平均光密度(MOD)值測定。

2 結果

2.1影像學檢查結果 2周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)部分軟骨痂，均無明顯骨連接。4周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)的骨連接增多，見圖1；根據(jù)Garrett評分標準，與對照組相比，第2、4周時GHI組和陽性藥組評分均升高，而術后6周，基本進入塑形期，見表1。

圖1 各組大鼠骨折后X線情況Fig.1 Condition of X-ray after fracture in rats of each group

表1 各組大鼠骨組織評分

2.2骨密度測定 在術后3個時段測定BMD值結果顯示，GHI組和陽性藥組BMD值均高于對照組(P<0.05)，但GHI組與陽性藥組組間差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2 各組大鼠骨密度值Fig.2 Done mineral density of rats in each groupNote:n=8.Compared with control group,*.P<0.05.

2.3骨組織HE染色結果 第2周時，GHI組和陽性藥組HE切片軟骨細胞數(shù)量多于對照組，同時部分出現(xiàn)不成熟骨小梁，而對照組無骨小梁。4周時，對照組骨折端仍以軟骨組織為主，少數(shù)切片存在纖維組織。GHI組和陽性藥組的軟骨組織及纖維組織逐漸被不成熟骨組織替代，甚至部分出現(xiàn)較成熟骨小梁結構。6周時對照組和GHI組以軟骨組織與不成熟骨組織交替為主，而陽性藥組出現(xiàn)部分成熟骨組織，3組間無明顯差異，見圖3。

圖3 HE染色觀察骨組織變化Fig.3 Changes of bone tissues observed by HE

2.4血清ALP及FGF-2檢測結果 在術后2周，表現(xiàn)出陽性藥組ALP含量高于GHI組及對照組。但在第4、6周，對照組、陽性藥組和GHI組間ALP 含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而GHI組和陽性藥組血清中FGF-2含量在第2、4、6周時均明顯高于對照組(P<0.01)，見圖4。

圖4 各組大鼠血清ALP及FGF-2變化Fig.4 Changes of serum ALP and FGF-2 in each groupNote:Compared with control group,*.P<0.05,#.P<0.01.

2.5骨組織FGF-2表達結果 在造模成功后第2周GHI組和陽性藥組MOD值均較對照組高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；第4周時各組FGF-2的MOD值較第2周均下降，但GHI組和陽性藥組MOD值均比對照組高(P<0.01)，GHI組和陽性藥組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后第6周，3組間MOD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 各組大鼠不同時段FGF-2表達變化Fig.5 Changes of FGF-2 expression in different periods of rats in each groupNote:n=8.Compared with control group,*.P<0.05；#.P<0.01.

3 討論

骨折愈合被認為是骨重建過程，在骨的形成和再吸收過程中破骨細胞和成骨細胞發(fā)揮重要作用，而骨細胞通過調節(jié)骨的形成和再吸收，影響破骨細胞和成骨細胞[6，7]。目前對GHI在骨折愈合方面的研究較少，同時缺乏驗證其療效的國際公認的影像學及組織學評判標準。因此本研究目的是觀察不同時段GHI對FGF-2表達的影響以及促骨折愈合的效果。

骨肽注射液含有多種骨代謝的活性肽類，具有促進骨細胞增殖和破骨細胞凋亡的作用[8，9]，因此本實驗將骨肽注射液作為陽性對照藥物；谷紅注射液是由乙酰谷酰胺和紅花提取液制成的滅菌水溶液，紅花提取液含有紅花黃色素及紅花苷類等有效成分，具有抗氧自由基、抑制血小板凝聚、改善微循環(huán)及降血脂等作用，但有關骨折方面研究甚少[10,11]。

影像學結果顯示，2周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)部分軟骨痂，均無明顯骨連接。4周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)的骨連接更多。根據(jù)Garrett評分標準，與對照組相比，第2、4周時GHI組和陽性藥組評分均升高，術后6周，基本進入塑形期。說明GHI組和陽性藥組具有促進早期骨折愈合效果；BMD檢查結果顯示，在不同的時段GHI組和陽性藥組BMD值均高于對照組，說明GHI組具有增加骨礦含量的作用；骨組織HE染色結果顯示，第4周時，對照組骨折端仍以軟骨組織為主，GHI組和陽性藥組的軟骨組織及纖維組織逐漸被不成熟骨組織替代，這說明谷紅注射液能有效促進骨愈合；ALP檢測結果顯示，在術后2周，GHI組ALP含量高于對照組(P<0.05)，這說明GHI刺激 ALP 活性，促進成骨細胞增殖，與增強骨鈣素轉錄和膠原的分泌等密切相關[12]。在第4、6周，3組大鼠ALP含量變化不明顯。這可能原因是：ALP被認為是骨礦化早期標記物，因此GHI對早期ALP刺激作用明顯，而對后期ALP刺激作用減弱，導致ALP表達下降。ALP、BMP增加可能促進成骨細胞分化和骨基質分泌，進而促進骨折愈合。

FGF-2廣泛存在于人體內，參與器官創(chuàng)傷修復，屬于創(chuàng)傷愈合因子之一。FGF-2能通過趨化作用使巨噬細胞、成纖維細胞等細胞向創(chuàng)傷部位聚集，從而促進創(chuàng)傷的愈合，同樣在骨折愈合中也起到重要作用[13，14]。實驗結果顯示在血清和骨組織中，GHI能促進FGF-2表達，在骨折造模后第 2 周FGF-2血清含量和蛋白表達到達高峰，GHI組和陽性藥組MOD值均較對照組高(P<0.01)，而在第4、6周FGF-2表達均逐漸下降，與文獻報道結果基本一致[15]。而且GHI組大鼠骨折部位FGF-2表達較對照組明顯增加，提示GHI促進骨折端FGF-2表達與大鼠骨折愈合相關，且GHI可能通過FGF-2的作用，在骨折愈合早期促進血管的形成，促進骨折愈合。

綜上所述，本實驗通過建立骨折大鼠模型，在不同時段從影像學、組織學等方面進行評估，證實GHI能促進大鼠骨折愈合，其機制可能與促進 FGF-2 表達有關，但具體機制需要進一步研究。