siRNA沉默NOK基因抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖與侵襲①

吳榮強 孫穎盺 張 平 宗 明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州二院檢驗科，常州 213004)

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其基因治療的瓶頸之一是無法找到關(guān)鍵治療靶點。NOK(novel oncogene with kinase-domain)基因是 2004 年從人扁桃體癌中克隆的全新癌基因，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor protein tyrosine kinases，RPTKs)家族成員，與成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)具有20%～30% 的同源性，與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有共同的下游信號通路[1，2]。既往研究證實NOK基因在人腦膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，且其表達(dá)與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性程度呈正相關(guān)，提示NOK表達(dá)對維持腦膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)特性具有重要作用[3]。但NOK基因如何通過胞外信號進(jìn)行激活的機制尚未明確。為此，本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)干擾NOK基因表達(dá)，探討其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251生長、侵襲及凋亡的影響，闡明NOK基因在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自基爾頓生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibico公司；胎牛血清購自Hyclon公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamineTM2000和Trizol reagent均購自Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄采用M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega公司；CellTiter96 Aqueous One Solution Reagent (MTS試劑)購自Promega公司；SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒購自TaKaRa公司；AnnexinV-FITC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；NOK antibody (ab97451)、Cyclin D1 antibody (ab16663)購自Abcam公司；Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit (#9916)購自CST公司；siRNA由上海吉瑪公司合成；定量PCR引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1siRNA序列設(shè)計 NOK siRNA靶序列根據(jù)siRNA設(shè)計原則及NOK基因的cDNA序列(NM_018423.3)設(shè)計，使用Ambion公司在線設(shè)計軟件設(shè)計針對NOK基因編碼區(qū)的干擾核苷酸鏈2對，序列經(jīng)BLAST同源序列分析后由公司合成。篩選出2組siRNA進(jìn)行實驗，分別為：si-578：Oligo1，5′-CCAGGAGAAGCAGUAUGAAGUGAUUTT-3′，Oligo2，5′-AAUCACUUCAUACUGCUUCUCCUGGTT-3′；si-996：Oligo1，5′-CAAGAUUUCUUAGGGCGAAUCC-AAUTT-3′，Oligo2，5′- AUUGGAUUCGCCCUAAGAA-AUCUUGTT-3′。

1.2.2脂質(zhì)體介導(dǎo)NOK siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞 DEPC水將siRNA溶解為20 μmol/L的母液，轉(zhuǎn)染前24 h以1×105個/ml 接種于6 孔板，次日轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%。設(shè)置空白對照組和siRNA組，按比例混勻 opti-MEM和LipofectamineTM2000，靜置5 min，另按比例配制opti-MEM和20 pM siRNA，混合后室溫放置20 min，將細(xì)胞換成不含抗生素培養(yǎng)液，加入上述混合液搖勻，4～6 h后換成含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2.3熒光定量PCR檢測NOK mRNA水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物。NOK-F：5′-CGTTCTGGACCTCAAGGCAT-3′，NOK-R：5′-ACCACTGCAAATCTGCTCCA-3′，參比基因GAPDH-F：5′-ACCATGGGGAAGGTGAAG-3′，GAPDH-R：5′-AATGAAGG-GGTCATTGATGG-3′。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書配制50 μl反應(yīng)體系，熒光定量PCR儀擴增。反應(yīng)條件為：95℃ 10 s，95℃ 5 s，65℃ 34 s二步法擴增40循環(huán)，溶解曲線分析采用95℃ 15 s； 60℃ 30 s，95℃ 15 s；解離時間為4 s。NOK相對表達(dá)量用2-△△Ct表示，△Ct=CtNOK- CtGAPDH，△△Ct=△Ct樣本-△Ct參考樣本。

1.2.4Western blot檢測NOK、Cyclin D1蛋白表達(dá)變化及AKT磷酸化水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染NOK siRNA 48 h后加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，經(jīng)蛋白定量后，Western blot檢測各組NOK(1∶300)、Cyclin D1(1∶100)、AKT(1∶1 000)和P-AKT(1∶1 000)蛋白表達(dá)。

1.2.5MTS法檢測細(xì)胞增殖 調(diào)整各組細(xì)胞濃度為1×104個/ml，置于96孔板(100 μl/孔)，每隔24 h測定1次MTS。測試時，每孔加入20 μl CellTiter96 Aqueous One Solution Reagent孵育4 h后于酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度，繪制增殖曲線。

1.2.6平板細(xì)胞克隆形成試驗 取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，200個/孔加入6孔板，每3～4 d換液，10～14 d后結(jié)晶紫染色。染色步驟：PBS洗2次，1 ml甲醇固定20 min，1 ml結(jié)晶紫染色20 min，細(xì)流水沖洗干凈，干燥后拍照。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 NOK siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞1×106個，PBS洗滌2次(1 000 r/min，5 min)，棄上清，70%酒精重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/管，離心，棄上清。加入500 μl PBS重懸細(xì)胞和1 μl RNase A，1 000 r/min離心10 min棄上清。加入100 μl PI染色液避光染色10 min，流式細(xì)胞儀術(shù)檢測細(xì)胞周期。增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.2.8Annexin V-FITC/7-AAD 雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 NOK siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-FITC/7-AAD雙染法說明書處理樣本，避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.9Transwell體外侵襲實驗 應(yīng)用12孔Transwell培養(yǎng)板檢測各組細(xì)胞侵襲能力，每組設(shè)置3個復(fù)孔。上室聚碳酸酯膜Matrigel(3.9 μg/μl)于37℃聚合，各組消化、計數(shù)1×105個細(xì)胞，無血清DMEM培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液；下室加入600 μl無血清培養(yǎng)48 h的NIH3T3細(xì)胞條件培養(yǎng)液作為趨化因子，培養(yǎng)24 h后，用濕棉簽擦去上室附著細(xì)胞，蘇木精染色，封片后顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。每張膜的中央部分、周圍部分各隨機取3個視野，記錄每個視野內(nèi)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1NOK mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的變化 NOK的蛋白表達(dá)明顯降低(圖1A)。處理組均出現(xiàn)明顯的基因沉默效應(yīng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 轉(zhuǎn)染NOK siRNA對U251細(xì)胞中NOK mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effeet of NOK siRNA on NOK mRNA and protein in U251 cellsNote: Compared with Control and si-NC group,*.P<0.05.

2.2NOK siRNA對U251細(xì)胞增殖的抑制作用 MTS法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，24 h干擾組與對照組細(xì)胞生長差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，48 h后si-578和si-996組顯著抑制U251細(xì)胞增殖(P<0.05，圖2A)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-578和si-996組細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低(P<0.05，圖2B)。

圖2 NOK siRNA對U251細(xì)胞增殖和克隆形成的影響Fig.2 Effect of NOK siRNA on proliferation and colony formation in U251 cellsNote:Compared with Control and si-NC group,*.P<0.05.

2.3NOK siRNA對U251細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-578和si-996組中處于S期的細(xì)胞明顯減少，G0/G1期細(xì)胞明顯增多(P<0.05，圖3A)，G2期細(xì)胞無明顯變化。Western blot檢測相關(guān)周期蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示干擾組AKT磷酸化水平和Cyclin D1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05，圖3B)。

圖3 NOK siRNA對U251細(xì)胞周期和AKT磷酸化的影響Fig.3 Effect of NOK siRNA on U251 cell cycle and AKT phosphorylationNote:Compared with si-NC,*.P<0.05.

2.4NOK siRNA對U251細(xì)胞凋亡的影響 流式結(jié)果顯示,與對照組相比，si-578和si-996組細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.001，表1)；活細(xì)胞比率由94.2±8.2降低到79.5±7.6和81.2±6.9(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組U251細(xì)胞凋亡水平Fig.4 Flow cytometry to detect apoptosis level of U251 cells in each group

表1 各組別細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.5NOK siRNA對U251細(xì)胞侵襲的影響 24 h穿過基質(zhì)膠并貼于聚碳酸脂膜底面的細(xì)胞數(shù)分別為si-NC(14.2±4.6)個/HP，si-578(4.1±2.2)個/HP和si-996(6.4±3.7)個/HP，與si-NC組相比，si-578和si-996組細(xì)胞侵襲能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 NOK siRNA對U251細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)Fig.5 Effect of NOK siRNA on cell invasiveness in U251 cellsNote:Compared with si-NC,*.P<0.05.

3 討論

RPTKs在細(xì)胞增殖、分化和生長中發(fā)揮重要作用，對維持細(xì)胞正常功能具有重要意義[4-5]。RPTKs 的表達(dá)和活性異?？梢鹣鄳?yīng)信號通路失調(diào)從而引發(fā)腫瘤。NOK可轉(zhuǎn)化NIH3T3和BaF3細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤形成，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處多個器官[6]。體內(nèi)和體外實驗顯示NOK能激活MAP激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[7-9]。NOK基因廣泛高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織，如肺癌、乳腺癌、急性髓系白血病、卵巢癌和前列腺癌等，提示NOK可能蛋白可能對胚胎發(fā)育和腫瘤生成具有調(diào)控作用[10-13]。臨床研究提示NOK可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究借助siRNA技術(shù)初步探索了NOK在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中的部分生物學(xué)作用，為進(jìn)一步了解NOK在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路中的作用提供理論基礎(chǔ)。

腦膠質(zhì)瘤具有無限增殖和抗細(xì)胞凋亡的惡性表型，在其惡性演化過程中，腫瘤細(xì)胞密度逐漸增加，核分裂象多見，核異型性明顯[14-15]。其分子遺傳學(xué)改變涉及多種癌基因的激活、抑癌基因突變、失活及細(xì)胞周期基因和凋亡相關(guān)基因改變。研究顯示，NOK可在U251細(xì)胞中表達(dá)，而siRNA可明顯抑制U251細(xì)胞中NOK的轉(zhuǎn)錄，降低其表達(dá)，使U251細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變。MTS結(jié)果顯示si-578和si-996組細(xì)胞與si-NC組細(xì)胞相比生長明顯變緩(P<0.05)；平板克隆形成實驗同樣顯示干擾組與對照組相比克隆形成能力明顯減弱(P<0.05)，與目前NOK基因在其他腫瘤方面的研究結(jié)果一致[16]。細(xì)胞周期分析顯示，si-578和si-996組與si-NC組細(xì)胞相比S期細(xì)胞數(shù)減少，G0/G1期細(xì)胞均明顯增多，表明NOK基因調(diào)控U251的細(xì)胞周期主要是通過G1期的滯留實現(xiàn)的，干擾NOK基因后細(xì)胞G0/G1期明顯延長，S期縮短，抑制細(xì)胞有絲分裂。干擾NOK基因表達(dá)后，AKT的磷酸化水平及Cyclin D1表達(dá)均顯著降低。Cyclin D1為G1/S的重要調(diào)控蛋白，通過結(jié)合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的 Rb 蛋白從其所結(jié)合的 E2F 轉(zhuǎn)錄因子上解離，從而推動細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期。既往研究證實NOK基因可引起B(yǎng)aF3細(xì)胞中RAS/MAPK和PI3K通路活性上調(diào)[7]。RAS/MAPK和PI3K通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的重要途徑，其活性上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。PI3K/AKT為Cyclin D1上游重要的調(diào)控信號通路[17]。本研究中干擾組細(xì)胞中AKT磷酸化水平和Cyclin D1表達(dá)水平均顯著降低，推測NOK基因可能通過激活A(yù)KT信號調(diào)控Cyclin D1，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和增殖，課題組將進(jìn)一步證實。逃避各種因素誘導(dǎo)的凋亡是膠質(zhì)瘤細(xì)胞促進(jìn)其惡性進(jìn)展又一特征。本研究顯示干擾組U251凋亡明顯增加，說明NOK基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。體內(nèi)外腦膠質(zhì)瘤侵襲模型研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤周邊的膠質(zhì)瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強的侵襲能力，可脫離腫瘤實體移行較遠(yuǎn)距離，是造成腦膠質(zhì)瘤手術(shù)難以徹底切除和術(shù)后復(fù)發(fā)的重要原因。研究顯示，NOK siRNA處理組的細(xì)胞侵襲能力明顯下降，側(cè)面證實NOK基因在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起重要作用。NOK基因具有與EGFR有共同的下游信號通路，能夠誘發(fā)腫瘤，促進(jìn)其增殖和分化，這些功能可能是通過激活EGFR下游信號通路，如 RAS/MAPK、PI3K/AKT 和 STAT 等信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，干擾NOK基因表達(dá)后可在體外顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251生長、增殖及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為明確NOK調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機制奠定基礎(chǔ)。