去氫駱駝蓬堿及其衍生物DH-004的急性毒性研究

李紅玲， 趙 軍， 高惠靜， 陳 蓓， 王建華

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054)

去氫駱駝蓬堿為蒺藜科(Zygophyllaceae)駱駝蓬屬植物的駱駝蓬(PeganunharmalaL.)中分離提純的生物堿，具有抗炎止癢[1]、抗銀屑病[2]、抗包蟲[3]、抗腫瘤[4-6]等作用。研究表明[7-8]，去氫駱駝蓬堿具有神經(jīng)毒性作用，由于β-咔啉類生物堿的結(jié)構(gòu)與1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP，強(qiáng)黑質(zhì)毒素，可誘發(fā)帕金森病)相似，此類化合物也具有類似內(nèi)源性神經(jīng)毒素的毒性作用。通過對去氫駱駝蓬堿的β-咔啉類生物堿母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，經(jīng)衍生化反應(yīng)合成去氫駱駝蓬堿衍生物，達(dá)到減毒增效的目的[9]。有研究報(bào)道對去氫駱駝蓬堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以在確保其生物活性的同時(shí)，有效降低其毒性，結(jié)構(gòu)修飾后的衍生物在體外有較好的抗腫瘤[10-11]、抗寄生蟲病[12]等作用。本研究采用Bliss法探究去氫駱駝蓬堿及其衍生物DH-004的急性毒性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SYXK(新)2011-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號：IACUC-20130425011。

1.2 儀器電子天平(德國sartorius公司)。

1.3 試藥去氫駱駝蓬堿(新疆華世丹藥業(yè)有限公司，純度達(dá)到99%以上)；去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004(新疆華世丹藥業(yè)有限公司，純度達(dá)到99%以上)；吐溫-80(Tween-80，湖南爾康制藥有限公司，批號20121201)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20021113)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配置稱取去氫駱駝蓬堿原料藥50 mg，溶于10 mL生理鹽水中，配置成濃度為5 mg/mL的母液；稱取去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004原料藥50 mg，放入研缽中，加入適量Tween-80潤濕，加入10 mL的0.5%CMC-Na，配制成濃度為5 mg/mL的混懸液，備用。

2.2 去氫駱駝蓬堿給藥劑量的考察取昆明種小鼠20只，雌雄各半，禁食6～8 h，按給藥劑量(31、62、125、250、500 mg/kg體質(zhì)量去氫駱駝蓬堿)隨機(jī)分為5組，每組4只，采用腹腔注射，給藥后觀察14 d，記錄每組小鼠死亡數(shù)量。根據(jù)小鼠死亡情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整給藥劑量，得出最大劑量Dn(0%死亡率)值和全部動(dòng)物死亡的最小劑量Dm(100%死亡率)值。結(jié)果去氫駱駝蓬堿的給藥劑量為31～125 mg/kg體質(zhì)量，依據(jù)公式，計(jì)算得出組間距r值為1.3，見表1。

2.3 去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004給藥劑量的考察取昆明種小鼠12只，雌雄各半，禁食6～8 h，按給藥劑量(125、250、500 mg/kg體質(zhì)量DH-004)隨機(jī)分為3組，每組4只，采用腹腔注射，給藥后觀察14 d，記錄每組小鼠的死亡數(shù)量。根據(jù)小鼠死亡情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整給藥劑量，得出最大劑量Dn(0%死亡率)值和全部動(dòng)物死亡的最小劑量Dm(100%死亡率)值。結(jié)果去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004的給藥范圍為125～500 mg/kg體質(zhì)量，依據(jù)公式，計(jì)算得出組間距r值為1.3，見表2。

表1 去氫駱駝蓬堿給藥劑量的考察

表2 去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004給藥劑量的考察

2.4 去氫駱駝蓬堿半數(shù)致死量(LD50)的測定取昆明種小鼠60只，雌雄各半，禁食6～8 h，按給藥劑量(31.0、40.3、52.4、68.1、88.5、115.1 mg/kg體質(zhì)量去氫駱駝蓬堿)隨機(jī)分為6組，每組10只，采用腹腔注射，給藥后觀察14 d，記錄各組小鼠的死亡率，根據(jù)Bliss法計(jì)算小鼠對去氫駱駝蓬堿中毒的LD50及95%的置信區(qū)間。結(jié)果去氫駱駝蓬堿的LD50為49.40 mg/kg體質(zhì)量，95%置信區(qū)間為41.44～57.62 mg/kg體質(zhì)量，見表3。

表3 去氫駱駝蓬堿的LD50測定結(jié)果

2.5 去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004半數(shù)致死量(LD50)的測定取昆明種小鼠60只，雌雄各半，禁食6～8 h，按給藥劑量(125.0、162.5、211.2、274.6、357.0、464.1 mg/kg體質(zhì)量DH-004)隨機(jī)分為6組，每組10只，采用腹腔注射，給藥后觀察14 d，記錄各組小鼠的死亡率，根據(jù)Bliss法計(jì)算出小鼠對去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004中毒的LD50及95%的置信區(qū)間。結(jié)果去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004的LD50為252.66 mg/kg體質(zhì)量，95%置信區(qū)間為220.60～289.72 mg/kg體質(zhì)量，見表4。

表4 衍生物DH-004的LD50測定結(jié)果

2.6 各組小鼠中毒癥狀去氫駱駝蓬堿各劑量組小鼠在腹腔注射給藥5 min后即出現(xiàn)中毒癥狀，主要表現(xiàn)為如震顫、躁動(dòng)不安、抽搐等情況，且劑量越高，癥狀也愈加嚴(yán)重，在30 min內(nèi)，中毒癥狀嚴(yán)重的小鼠即出現(xiàn)死亡，中毒癥狀輕微的小鼠開始緩解。第2天，存活小鼠的中毒癥狀基本已恢復(fù)。去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004各劑量小鼠腹腔注射給藥30 min后即出現(xiàn)中毒癥狀，主要如震顫、心跳加快、躁動(dòng)不安、抽搐等情況，且劑量越高，癥狀也愈加嚴(yán)重，在2 h內(nèi)，中毒癥狀嚴(yán)重的小鼠即出現(xiàn)死亡，中毒癥狀輕微的小鼠開始緩解。第2天，存活小鼠的中毒癥狀基本已恢復(fù)。兩種藥物小鼠表現(xiàn)出的中毒癥狀相似，中毒癥狀時(shí)間稍有不同，衍生物DH-004較去氫駱駝蓬堿出現(xiàn)中毒癥狀時(shí)間較晚。

3 討論

半數(shù)致死量(LD50)在藥理學(xué)、毒理學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域早已廣泛應(yīng)用，目前測定LD50的方法較多，主要有累計(jì)法、序貫法、寇氏法、Bliss法等。Bliss法具有精確度高和可靠性強(qiáng)的特點(diǎn)，常多作為新藥LD50的測定評價(jià)方法[13]。本研究采用Bliss法測定去氫駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004的LD50，小鼠經(jīng)腹腔注射給藥后，去氫駱駝蓬堿的毒性大于去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004的毒性，表明結(jié)構(gòu)修飾后達(dá)到了減毒的效果。注射去氫駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿衍生物DH-004的小鼠中毒癥狀相似，表現(xiàn)為震顫、心跳加快、躁動(dòng)不安、抽搐等。本研究為去氫駱駝蓬堿衍生物的后續(xù)研究提供了毒理學(xué)理論基礎(chǔ)。