胰液中循環(huán)游離DNA甲基化異常在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用

周 艷，寧 波

重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，重慶 400000

胰腺癌是世界上最致命的癌癥之一，是中國第六大癌癥相關(guān)死亡原因[1]和全球第七大癌癥相關(guān)死亡原因[2]，其5年生存率不超過5%[3]。由于胰腺其位于腹膜后深層的特殊解剖位置，且毗鄰十二指腸和膽總管，以及其臨床癥狀的非特異性，使得患者確診時往往已經(jīng)錯過了最佳治療時期。只有少數(shù)患者在診斷時可以進行根治性切除[4]，且術(shù)后根治性切除率不足20%[5]。早期診斷胰腺癌是改善其預后的最佳和目前唯一的選擇[4]。目前臨床應(yīng)用最廣泛的血清腫瘤標志物(CA19-9、CEA)特異度較低，在急性胰腺炎、急性肝炎、肝硬化、胃癌等疾病中也可能出現(xiàn)升高。診斷胰腺癌的影像學手段主要有CT、MRCP及MRI，內(nèi)鏡手段如經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)和內(nèi)鏡超聲(EUS)。但胰腺存在諸多占位性質(zhì)的病變，除了胰腺癌以外，還有胰腺炎性實性占位、異位組織及囊性及囊實性占位等，使用影像學手段要做到準確地判斷胰腺占位性質(zhì)往往非常困難。盡管近幾年超聲內(nèi)鏡引導下細針穿刺活檢(EUS-FNA)為部分患者解決了這一診斷難題[6]，但這是一種侵襲性操作，有時由于病灶周圍主要血管的原因，解剖學上難以接近胰腺腫塊。另外在EUS-FNA的操作過程中還存在癌細胞播散風險。為了改善預后，迫切需要尋找一種臨床應(yīng)用方便的、微創(chuàng)的和對早期診斷有較大價值的胰腺癌診斷方法。

1 DNA甲基化與胰腺癌

目前許多研究已經(jīng)證明異常的DNA甲基化是多種腫瘤發(fā)生的早期事件，不同種類的腫瘤顯示一個或多個基因的異常甲基化(表1)[5]。研究者們針對胰腺癌的DNA異常甲基化也做了大量的研究，還深入探討了它們在胰腺癌早期診斷中的效用。Yi等[7]發(fā)現(xiàn)了ADAMTS1與BNC1基因在胰腺癌細胞中的異常甲基化，還發(fā)現(xiàn)BNC1甲基化陽性率隨著胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)的等級增加而增加。同時Sato與Fukushima等[8-10]的多項研究顯示以CDH3為首的9個基因甲基化陽性率也有這一現(xiàn)象，在胰腺癌細胞中這些基因的異常甲基化更為頻繁，其中UCHL甲基化陽性率達100%。Ginestà等[11]有試驗證明HRH2、EN1、SPARC、CDH13、APC中兩個或多個啟動子高甲基化對胰腺癌有診斷意義。楊衛(wèi)華等[12]研究表明p16基因啟動子區(qū)甲基化異常水平與胰腺癌組織分化程度、有無轉(zhuǎn)移、PTMN分期有關(guān)。Parsi 等[13]通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative methylation specific PCR,QMSP)檢測了膽道或/和胰管狹窄患者的內(nèi)窺鏡刷取樣本，發(fā)現(xiàn)NPTX2、TFPI-2、cyclin D2基因的甲基化狀態(tài)可以鑒別胰腺癌、其他壺腹部周圍癌、良性壺腹周圍疾病。Park等[14]也指出胰腺癌細胞學樣本的NPTX2甲基化檢測比病理學檢測敏感度更好。除基因異常高甲基化之外，異常低甲基化也可通過上調(diào)癌基因的表達參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Yokoyama等[15]的研究結(jié)果顯示胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中MUC1 和 MUC4 的啟動子區(qū)域存在DNA 異常低甲基化。還有研究[16-18]發(fā)現(xiàn)MUC4啟動子的低甲基化在PDAC和PanIN-H細胞中的頻率顯著高于PanIN-L和正常胰腺細胞。Sato等[19]在5種胰腺癌細胞株中也發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-7和MMP-9基因呈低甲基化狀態(tài)。這些研究提供了PanIN-PDAC進展模型中多種基因異常甲基化頻率增加的證據(jù)，同時癌癥基因組圖譜和國際癌癥基因組聯(lián)盟已經(jīng)為包括胰腺癌在內(nèi)的25種癌癥類型的數(shù)千個腫瘤樣本生成了甲基化基因組數(shù)據(jù)[20-22]。DNA甲基化檢測不僅有助于胰腺癌的早期診斷，或許還能在胰腺癌的一級預防中發(fā)揮一定的作用。因此，需要選取一種易獲取、準確性高的標本用于DNA甲基化檢測，包含循環(huán)游離DNA(cell free DNA，cfDNA)、循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)在內(nèi)的液體活檢技術(shù)作為一種新興技術(shù)為研究者們提供了新思路。

表1 人類癌癥中常見的甲基化基因及其在腫瘤發(fā)展中的作用

2 cfDNA甲基化與胰腺癌

cfDNA最初是指游離于細胞外的DNA片段，存在于血漿、血清以及其他體液中，長度100～300 bp，它可以是正常組織細胞釋放的DNA片段，也可以是腫瘤細胞或者其轉(zhuǎn)移灶釋放出的含有腫瘤異常DNA信息的片段，因此也被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。正常人體循環(huán)中含的cfDNA非常低，超過90%的人每毫升血漿中不超過25 ng，而腫瘤患者可以達到數(shù)倍。尤為重要的是，ctDNA中包含有大量與腫瘤有關(guān)的信息，如癌基因的突變，與腫瘤發(fā)生有關(guān)的細胞信號通路的異常和遺傳表觀修飾的異常等。因此，通過檢測ctDNA與CTC，能夠早期、高敏感、高特異診斷腫瘤并提供精準醫(yī)療的信息，它們一起被稱為腫瘤的液體活檢技術(shù)。

有很多學者都探索了cfDNA甲基化異常對胰腺癌診斷的價值，初步的結(jié)果是令人振奮的。Kisiel等[23]利用檢測糞便中DNA的甲基化異常標志來診斷胰腺癌。Thompson等[24]通過分析胰腺癌患者的甲基化異常特征發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織甲基化異常與患者生存率密切相關(guān)。Kisiel等[25]甚至還通過甲基化特異性PCR的辦法對胰液中的CD1D、KCNK12、CLEC11A、NDRG4、IKZF1、PKRCB, 以及KRAS等多個胰腺癌相關(guān)的標志物位點甲基化做了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以CD1D為首的標志物甲基化異常對胰腺癌診斷有特別的價值。Yi等[7]針對胰腺癌患者的血清標本進行了分析，結(jié)果顯示BNC1、ADAMTS1兩種基因一起用于胰腺癌早期診斷時的敏感度和特異度達81%、85%。Neale等[26]利用 Methy Light QMSP的方法通過研究白細胞中LINE-1、Alu and Sat2 DNA重復原件結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其過度甲基化可用于診斷胰腺癌，且其中LINE-1與胰腺癌危險度密切相關(guān)。因此，cfDNA及其甲基化異常的檢測能夠成為一種非常有潛力的診斷手段。

3 胰液cfDNA甲基化與胰腺癌

目前發(fā)表的文獻中選取的標本有血漿、白細胞、糞便、胰液以及腫瘤組織等。從標本的獲得性來講，糞便和血液最易獲得，而腫瘤組織最為困難。從準確性和最能反映腫瘤細胞的特征性角度講，腫瘤組織最佳，胰液次之，而血液和糞便更易受其他組織器官的干擾。因此。作者認為選取相對容易獲得且直接來源于胰腺的胰液最為合適。Ginesta等[27]對85例胰腺癌、26例壺腹癌、10例胰腺導管內(nèi)乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)、14例慢性胰腺炎患者的135份胰液進行了甲基化特異性熔解曲線分析，發(fā)現(xiàn)APC甲基化作為一個單獨的檢測標志來識別胰腺癌有很好的性能，其敏感度達71%，特異度達93%。在考慮所有腫瘤時，APC敏感度仍然很高(73%)。還有研究[28]指出檢測胰液樣本中MUC1、MUC2和MUC4啟動子的DNA甲基化水平可以區(qū)分胃型IPMN、腸型IPMN、其他型IPMN和PDAC。重要的是，在小胰腺癌(直徑<2 cm)患者的胰液樣本中也檢測到異常甲基化的DNA[10]。Matsubayashi等[29-30]與Yao等[31]的研究也表明了胰液的DNA甲基化檢測對胰腺癌、IPMN、慢性胰腺炎有良好的鑒別能力。兩項試驗都進一步通過QMSP對基因的甲基化進行了量化分析，發(fā)現(xiàn)檢測的敏感度比正常MSP更好。Nishizawa等[32]對比了胰液、常規(guī)活檢樣本與EUS-FNA細胞學樣本的CDO1啟動子甲基化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰液檢測胰腺癌的靈敏度達95%，明顯高于常規(guī)活檢樣本(33%)和EUS-FNA細胞學樣本(88%)。上述從胰液中提取cfDNA的研究中發(fā)現(xiàn)諸多異常甲基化的基因，并且對于診斷胰腺癌的敏感度、特異度尚佳。而獲取胰液的方式多種，Sato 等[9]的研究是直接從橫切的胰管中抽吸的胰液，Kisiel等[25]則是對患者靜脈注射促胰液素16 mg后通過十二指腸腔抽吸術(shù)收集的胰液，也有研究[29-30]是通過ERCP回收的胰液?，F(xiàn)在內(nèi)鏡技術(shù)非常發(fā)達，通過ERCP獲得胰液標本相對微創(chuàng)、準確，若留置鼻胰引流管(如果患者合并膽胰管梗阻)，還可以多次獲得標本用于評價治療效果和隨訪等。

4 總結(jié)

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其早期缺乏特異性癥狀，以及腫瘤的高生物攻擊性和抗細胞毒性藥物，都導致了胰腺癌的高致死率。為了改善胰腺癌的預后，人們對早期診斷的需求越來越高，因此迫切需要尋找一種早期診斷的新途徑。對胰腺癌的分子流行病學的研究[33]表明，從癌前病變到癌癥，從早期癌癥到晚期癌癥的進展速度較慢。這一間隔時間為發(fā)現(xiàn)癌前病變和早期的胰腺癌提供了機會。目前已在胰腺癌患者的胰液樣本中發(fā)現(xiàn)多種異常甲基化的基因，在其癌前病變中也有類似發(fā)現(xiàn)，例如PanIN患者、IPMN患者，這些基因無論是單獨的還是組合的，都有研究支持其作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物。但是其中一部分基因的異常甲基化在其他腫瘤中也有被檢測到。另外，正常組織中也存在低水平的DNA甲基化，并且對于某些基因，其陽性頻率會隨著年齡的增長而升高[30]。因此，仍需要大量的研究及實驗來推動胰液中cfDNA甲基化檢測在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用。

作者貢獻聲明：周艷負責課題設(shè)計，收集并分析資料，撰寫及修改論文；寧波負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。