中晚期宮頸鱗癌患者CTLA-4的表達與臨床特征分析

范佩文， 馬苗苗， 馮亞寧， 王若崢

(1新疆腫瘤防治研究所， 烏魯木齊 830011； 2新疆腫瘤學重點實驗室， 烏魯木齊 830011；3中國醫(yī)學科學院腫瘤免疫與放療研究重點實驗室， 烏魯木齊 830011；4新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院放療二科，烏魯木齊 830001)

宮頸癌目前依然是新疆地區(qū)婦女面臨的重大疾患之一，HPV作為宮頸癌獨立誘發(fā)因素，在宮頸病變惡化過程中發(fā)揮重要作用，同時，作為一種外源性病毒抗原，可以誘導機體發(fā)生免疫反應。腫瘤微環(huán)境中包含癌細胞、免疫細胞和多種細胞因子等成分，其中T細胞的數(shù)量和功能對宿主腫瘤細胞的清除起至關重要的作用，腫瘤抗原特異性T細胞的功能耗竭是造成腫瘤細胞免疫逃逸的主要機制，抗腫瘤應答的強弱直接影響腫瘤患者的預后[1-3]。

細胞毒性T淋巴細胞抗原-4 (cytotoxic-T-lymphocyte-antigen-4, CTLA-4)又稱CD152，屬于CD28免疫球蛋白亞家族，是一種主要由T細胞表達的抑制性受體，其基因位于2號染色體長臂33帶(2q33)上，其配體CD80和CD86通常存在于抗原遞呈細胞的表面，結合后分別產(chǎn)生共刺激或共同抑制反應[4-5]。研究表明，CTLA-4等免疫檢查點分子高表達是腫瘤T細胞功能性耗竭的重要標志[6-7]，并與腫瘤患者臨床特征、療效和預后有關[8-9]。通過阻斷這些免疫檢查點的信號通路，能有效地恢復耗竭T細胞的功能[10-11]。

本研究納入HPV16型感染的中晚期宮頸鱗癌患者，采用多色流式細胞技術檢測患者外周血和癌組織中T細胞上CTLA-4表達情況，對比分析宮頸癌患者外周血、癌組織中CD4+、CD8+T細胞上CTLA-4的表達差異，探討其表達與臨床特征的相關性，檢測宮頸癌患者放射治療過程中PBMCs中T細胞上CTLA-4等免疫檢查點分子的動態(tài)改化，為中晚期宮頸鱗癌患者放療聯(lián)合免疫治療的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集2017年2月-2018年8月，就診于新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科放射治療病區(qū)的63例中晚期宮頸鱗癌患者。所有患者均為HPV16型感染，年齡39～80歲；患者中IIB期31例,占49.2%，IIIA～IIIB期32例(50.7%)；低分化鱗癌20例(31.7%)，中分化鱗癌37例(58.7%)，乳頭狀鱗癌6例(9.5%)。收集行放射治療前、治療中和治療結束資料完整的患者22例，年齡范圍31～71歲；IIB期12例，III期10例；低分化鱗癌10例，中分化鱗癌12例。所有患者的治療均遵照衛(wèi)計委宮頸癌診療規(guī)范，NCCN指南(2018版)，行放射治療的患者采用適形調(diào)強技術進行盆腔外照射，外照射劑量為45～50 Gy；腔內(nèi)放療采用Ir192后裝機，腔內(nèi)后裝治療A點劑量為6G y/周，A點總劑量為36～42 Gy，周圍器官的保護劑量不大于A點劑量的60%。放療中給予同步化療，4～6個周期的順鉑40 mg/m2靜脈滴注，或3～4個周期的紫杉醇135 mg/m2靜脈滴注。對于不能耐受或拒絕化療的患者，僅行局部放射治療。

1.2 研究方法

1.2.1 血液樣本留取和處理 采集患者EDTA抗凝外周血10ml，經(jīng)4℃，3 000 rpm離心10 min后分離獲得血漿和血細胞，血細胞中按1：1體積加入RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma公司)混勻，加入等體積淋巴細胞分離液(Sigma公司)，密度梯度離心后獲得外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。

1.2.2 組織樣本留取和處理 取常規(guī)病理檢查之外剩余的活檢組織標本，大小約3 mm×3 mm×3 mm/塊，經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基漂洗后剪碎轉移到中，按照組織分離試劑盒說明書加入所需的分解酶，將組織消化懸液混勻后置于組織分離器(美天旎生物技術有限公司)上進行初步分解后，將C管置于旋轉器中進一步利用分解酶消化獲取單細胞。將分解消化后的組織懸液經(jīng)細胞篩過濾以獲取包含腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)的單細胞懸液。

1.2.3 流式細胞術檢測CTLA-4在CD4+T和CD8+T細胞上的表達 向分取的PBMCs和TILs中離心加入Live/dead染料，4℃避光染色20 min后，用FACS 清洗液洗滌兩次后，加入針對表面抗原的CD3(AF700， BD公司)、CD4(FITC， BioLegend公司)、CD8(APC-H7， BD公司)和CTLA-4(PE-Cy7， BioLegend公司)熒光標記抗體，再次避光染色后，用BD LSRFortessa流式細胞分析儀(BD公司)檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件包，圖表繪制采用GraphPad Prism 7.0進行；PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細胞上免疫檢查點分子CTLA-4的表達結果為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(25%，75%)描述；組間比較采用秩和檢驗；PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細胞上CTLA-4表達的相關性采用Spearman分析；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細胞CTLA-4的表達63例患者 PBMCs中CD4+ T細胞的CTLA-4表達量為4.59%，CD8+CTLA-4+T細胞的表達量為22.50(8.36，25.40)%； TILs中CD4+CTLA-4+T細胞的表達量為5.20(3.01，9.72)%，CD8+CTLA-4+T細胞的表達量為4.95(2.60，15.80)%。PBMCs和TILs中CD4+ T細胞上CTLA-4表達量對比分析，差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.751，P=0.052)；PBMCs中CD8+ T細胞上CTLA-4的表達量高于TILs，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-5.445，P<0.001)。見圖1。

2.2 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細胞CTLA-4表達的相關性患者PBMCs和TILs中CD4+CTLA-4+T細胞的相關性分析方程Y=-0.103X+8.827，差異無統(tǒng)計學意義(r=0.081，P=0.530)；PBMCs和TILs中CD8+CTLA-4+T細胞的相關性分析方程Y=0.361X+17.250，差異無統(tǒng)計學意義(r=0.184，P=0.149)； CD4+CTLA-4+和CD8+CTLA-4+T細胞在PBMCs和TILs中表達無相關性。見圖2。

圖1 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+T、CD8+T細胞CTLA-4的表達

圖2 中晚期宮頸癌患者PBMCs和TILs中CD4+T、CD8+T細胞CTLA-4表達的相關性

2.3 中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs和TILs中CD4+、CD8+T細胞CTLA-4的表達與臨床特征的對比中晚期宮頸鱗癌患者PBMCs中T細胞上CTLA-4的表達量在病理分級中比較，均發(fā)現(xiàn)在乳頭狀鱗癌中最高，其中CD4+T細胞的CTLA-4表達量中分化組為4.33(2.37，7.25)%、低分化組為4.97(1.48，8.78)%，乳頭狀組為17.55(8.29，31.90)%，差異有統(tǒng)計學意義(Z=7.741，P=0.021)；CD8+CTLA-4+T細胞的表達量在病理分級中比較，中分化組21.80(11.69，26.75)%、低分化組22.20(7.21，29.33)%，乳頭狀分組43.25(31.30，49.38)%，差異有統(tǒng)計意義(Z=7.741，P=0.021)；CTLA-4的表達在其他臨床特征間比較差異均無統(tǒng)計學意義?；颊逿ILs中CD4+CTLA-4+T和CD8+CTLA-4+T細胞表達量在各臨床特征間比較，差異均無統(tǒng)計學意義,見表1、2。

2.4 宮頸鱗癌患者PBMCs中放射治療前、中、后CD4+、CD8+T細胞CTLA-4表達的對比22例行放射治療的患者PBMCs中CD4+CTLA-4+T細胞的表達量在治療前、中和結束時分別為為3.94(1.85，5.70)%、6.80(3.38，41.13)%和7.86(4.47，13.23)%；放療前與放療中比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=-2.448，P=0.013)；放療前與放療結束時比較，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.653，P=0.008)；患者PBMCs中CD4+CTLA-4+T細胞的表達量隨放療進程呈升高趨勢。CD8+ T細胞的CTLA-4表達量在放療前、中和結束時分別為23.40(11.78，3.98)%、27.90(21.95，57.20)%和37.10(18.80，51.73)%，三者比較差異無統(tǒng)計學意義,見圖3。

表1 宮頸鱗癌患者PBMCs中CD4+T、CD8+T細胞CTLA-4的表達與臨床特征的比較

表2 宮頸鱗癌患者TILs中CD4+T、CD8+T細胞CTLA-4的表達與臨床特征的比較

圖3 22例中晚期宮頸鱗癌患者放療前、中、后PBMCs中CD4+T、CD8+T細胞CTLA-4的表達

3 討論

機體的免疫功能和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其中T細胞介導的免疫反應對清除腫瘤細胞和防止腫瘤發(fā)生轉移起關鍵作用[12-13]。正常情況下，機體可以利用免疫系統(tǒng)清除體內(nèi)的HPV，然而隨著持續(xù)感染的發(fā)生，機體的免疫系統(tǒng)對外源性抗原的識別和清除能力下降，使得受到HPV感染的細胞在宮頸局部組織中存活并大量繁殖，最終導致惡性腫瘤的生成[14-15]。作為影響T細胞功能的關鍵因素，CTLA-4和抗CTLA-4抗體通過介入免疫微環(huán)境，發(fā)揮高效功效并補充傳統(tǒng)藥物而具有特殊的治療作用，從而為宮頸癌等惡性腫瘤的治療創(chuàng)造了新的機會。

已有研究報道,在卵巢癌微環(huán)境中，CTLA-4等共抑免疫檢查點分子參與可導致TILs失活，CTLA-4的阻斷有利于卵巢腫瘤碎片中CD8+ TILs的增殖，在腫瘤微環(huán)境中靶向CTLA-4可豐富腫瘤反應性TILs，并可能提高基于TILs的過繼療法在卵巢癌中的臨床療效[16]。此外，有學者利用37例宮頸癌患者的癌以及陽性淋巴結組織進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，CTLA-4、PD-1、Tim-3等免疫檢查點分子在T細胞上均有表達，并且在CD4+T細胞上的表達量CTLA-4>PD-1>Tim-3； CD8+T細胞上的表達量PD-1>CTLA-4>Tim-3[17]。本研究通過對HPV16型感染的中晚期宮頸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，外周血PBMC中CTLA-4的表達量在CD8+T細胞中22.50(8.36，25.40)%高于CD4+T細胞中4.59(2.06，7.78)%；而癌組織TILs中CD4+CTLA-4+T細胞的表達量5.20(3.01，9.72)%高于CD8+CTLA-4+T細胞的表達量為4.95(2.60，15.80)%，這與上述學者的研究結果較為一致。

本研究分析發(fā)現(xiàn)患者CD8+CTLA-4+T細胞的表達量在PBMCs中顯著高于TILs中(P<0.01)，而通過相關性分析發(fā)現(xiàn)PBMCs與TILs中的表達不存在相關性。推測可能由于CTLA-4基因可編碼2種形式的蛋白：一種是膜性蛋白，另一種是可溶性的單體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4表達于活化的CD4+、CD8+T細胞膜上，在靜息和幼稚T細胞中不表達，而是滯留在某些細胞器中，如高爾基體、內(nèi)質網(wǎng)、囊泡等；當T細胞活化后，這些滯留的CTLA-4蛋白能夠迅速轉移至細胞膜表面[18]。Adriana 等[19]測定了CTLA-4在不同宮頸癌細胞系細胞表面的表達，結果顯示其在細胞表面非常低或不表達，因此進一步評估了該蛋白的細胞內(nèi)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)所有宮頸癌細胞系都表達CTLA-4 (0.5～35%)，也證明了該推測。另外本實驗采用流式細胞技術僅檢測到外周血中T細胞膜上CTLA-4表達，也可能是出現(xiàn)此結果的原因，需要進一步研究驗證。

有研究者利用宮頸癌患者和健康女性的血漿，采用改良的ELISA方法檢測CTLA-4自身抗體，發(fā)現(xiàn)CTLA-4自身抗體在宮頸癌患者中的表達量高于健康女性對照者，在宮頸癌II期患者中高于I期患者[20]。本研究探討了外周血和癌組織中細胞上CTLA-4的表達與患者臨床特征的關系。結果顯示，PBMCs中CD4+和CD8+T細胞CTLA-4的表達量在病理分級上存在差異，在乳頭狀鱗癌組中表達量高于低分化組，中分化組表達量最低(P<0.05)。既往研究證實，在多種惡性腫瘤中CD4+或CD8+T細胞上CTLA-4的表達與臨床特征密切相關，如病理分級、臨床分期以及淋巴結轉移等，而免疫檢查點分子的過度表達對患者的預后也有影響[21]。

已有研究表明，電離輻射會直接造成DNA的損傷，并產(chǎn)生活性氧和自由基，導致DNA、蛋白質和脂質膜損傷，進而導致細胞畸形、凋亡、壞死甚至癌變[22]。本研究納入了22例接受放射治療的患者，收集放放療前、中期及結束時3個階段的外周血，檢測CTLA-4在T細胞中的表達情況。分析發(fā)現(xiàn)，隨著放療劑量的累積，患者CD4+T、CD8+T細胞中CTLA-4表達均有升高趨勢，隨著治療結束表達有下降趨勢，其中在CD4+T細胞中CTLA-4的表達量在放療前后差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示放射治療可能對機體有免疫抑制的影響。Wilkins等[23]報道了抗CTLA-4抑制劑ipilimumab聯(lián)合姑息性放療在39例非小細胞肺癌患者中的臨床結果和轉譯結果，研究發(fā)現(xiàn)有18%的患者存在放射學反應，并且有31%的患者病情得到了控制。這些臨床結果似乎優(yōu)于僅使用ipilimumab的歷史研究，并提示在一些患者中，輻射可能觸發(fā)了全身，即所謂的遠性免疫反應。表明通過優(yōu)化放射治療分割計劃和抗CTLA-4抑制聯(lián)合應用可以產(chǎn)生額外反應效應。

綜上所述，CTLA-4在宮頸癌患者外周血和癌組織中均有表達，且隨著放射治療劑量的累加存在變化。隨著對T細胞耗竭機制的深入研究和對腫瘤治療方法的不斷探索，新的免疫檢查點分子靶標的發(fā)現(xiàn)日新月異，靶向藥物的推陳出新，相信未來免疫治療會給宮頸癌患者的治療帶來更多希望。