小反芻獸疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法的建立

孫雨，宋曉暉，肖穎，王睿男，李秀梅，任雪建，李雪剛，魏巍，楊林，王傳彬*

(1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 大興 102600；2.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 400000；3.洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司，河南 洛陽 471000；4.登封市畜牧業(yè)服務(wù)中心，河南 登封 452470)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)，又稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性高熱、高度接觸傳染性疾病，主要感染小反芻動物，如山羊、綿羊、羚羊、美國白尾鹿等，其中以山羊最為嚴(yán)重，易感羊群的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[1]。進(jìn)入20世紀(jì)以來，在非洲利比亞、尼日利亞，以及中國、巴基斯坦等亞洲多地均有發(fā)生過PPR的報道[2-4]。目前尚無有效藥物治療PPR，對該病的成功控制策略主要依賴于疫苗免疫，而PPRV抗體水平的檢測是疫苗免疫效果評價的主要方法[5]。目前現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)主要包括病毒分離鑒定、PCR以及競爭ELISA抗體檢測方法等。最近幾年，PPR診斷技術(shù)在國內(nèi)外已有大量研究報道，相繼建立了多種檢測PPRV的新型方法，主要包括熒光免疫血清學(xué)方法和實(shí)時熒光定量PCR檢測方法等[6-8]。病毒的分離鑒定與血清中和試驗(yàn)是OIE診斷PPRV的金標(biāo)準(zhǔn)，這2個方法雖然較為準(zhǔn)確，但需要耗費(fèi)約幾天的時間才能獲得結(jié)果，并且操作技術(shù)復(fù)雜，生物安全要求高，不適用于基層獸醫(yī)快速診斷需求。反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時定量PCR已經(jīng)廣泛用于檢測PPRV，但這2種方法需要專業(yè)人員在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展，也給基層檢測人員診斷PPR帶來了一定的困難。血清學(xué)檢測主要以ELISA為主，檢測穩(wěn)定性與特異性具有一定的局限性。本研究建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法采用競爭原理，將PPRV的N蛋白作為包被抗原，包被于化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板上，待檢血清與酶標(biāo)單抗同時加入到化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板中，二者競爭性地與N蛋白上的相應(yīng)表位結(jié)合，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，讀取發(fā)光值，從而計算出動物血清中PPRV抗體含量，并判斷陰陽性結(jié)果。由檢測結(jié)果判定被檢動物體內(nèi)的PPRV抗體含量，具有較高的實(shí)用價值和推廣價值。

1 材料與方法

1.1 材料

PPRV N融合蛋白抗原由中國動物疫病預(yù)防控制中心(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心)制備保存；進(jìn)口PPRV抗體ELISA檢測試劑盒購自法國IDVET公司；脫脂奶粉購自美國Oxoid公司；魯米諾化學(xué)發(fā)光底物，購自洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司；化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，購自美國Thermo公司；10%的胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基與相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司；陰性與陽性樣本血清由中國動物疫病預(yù)防控制中心(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心)保存。

1.2 PPRV單克隆抗體的制備及純化

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞繁殖

將生產(chǎn)用細(xì)胞株2E5C4(中國動物疫病預(yù)防控制中心菌毒種保藏室保存)，用含有15%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液(pH=7.0)制成細(xì)胞懸液，置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48～72 h，細(xì)胞能夠穩(wěn)定分裂繁殖，可長成單層。

1.2.2 小鼠腹水制備

選取12～16周齡健康雄性BALB/c小鼠，按0.5 mL/只腹腔注射弗氏不完全佐劑，7～10 d后每只小鼠腹腔接種l×106～5×106個2E5C4株雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)7～10 d后可見小鼠腹部明顯膨大，無菌操作采集腹水。采集的腹水以8 000 r/min離心10 min，棄去上層脂肪層，收集中層腹水，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單克隆抗體的純化

采用辛酸飽和硫酸銨沉淀法，對制備的含有單克隆抗體的腹水進(jìn)行純化，純化后的單克隆抗體無菌定量分裝，-20 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單克隆抗體HRP標(biāo)記

稱取2 mg HRP溶解于0.5 mL蒸餾水中，加入0.5 mL新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，4 ℃避光30 min。加入160 mmol/L的乙二醇 0.5 mL，室溫放置30 min。加入純化的單抗2 mg，混勻。將上述溶液裝入透析袋中，置2 000 mL的PBS(pH=7.0)緩沖液中透析，4 ℃攪拌過夜。透析液吸至15 mL的離心管中，加0.2 mL新配的5 mg/mL NaBH4液，混勻，4 ℃放置12 h。將得到的產(chǎn)物用分子篩進(jìn)行層析，將未和單抗結(jié)合的辣根過氧化物酶去除。

1.2.5 酶結(jié)合物的制備

將制備的濃度為1 mg/mL酶標(biāo)單克隆抗體用酶結(jié)合物稀釋液按1∶8 000稀釋，攪拌均勻，無菌分裝，12 mL/瓶，置2～8 ℃保存。

1.3 樣本采集及處理

采集靜脈血時，每頭豬、?；蜓蚴褂靡粋€注射器。進(jìn)行靜脈無菌采血，不少于2 mL。傾斜放置于室溫中靜置2～4 h，待血液自然析出血清，必要時可低速離心(3 000 r/min離心10～15 min)，分離血清。

1.4 化學(xué)發(fā)光檢測步驟

①包被：將N重組蛋白用包被緩沖液稀釋到1.5 μg/mL，以100 μL/孔的量加入化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板中，置2～8 ℃包被16 h。②洗板：棄去包被液，將25倍濃縮洗滌液稀釋成1倍洗滌液，用(280±20)μL洗滌液洗滌板孔，洗板2次，每次洗滌后應(yīng)棄去孔內(nèi)的液體，最后1次洗滌液棄去后，將包被板在吸水紙上拍干，直至孔內(nèi)無殘留洗滌液。③封閉：每孔加入150 μL封閉液，置于37 ℃封閉2 h，棄去封閉液，在吸水紙上拍干。④干燥：置于37 ℃干燥3～5 h，將包被板裝入鋁箔袋，加干燥劑，抽真空，置于冰箱2～8 ℃保存?zhèn)溆?。⑤樣品稀釋：在血清稀釋板中，用樣品稀釋液將待檢樣品按照1∶20比例進(jìn)行稀釋。⑥加樣：取出包被板，每次試驗(yàn)需設(shè)置系列校準(zhǔn)品6孔。首先在血清稀釋板上依次加入校準(zhǔn)品1～6各60 μL，其余各孔依次加入待檢樣品各60 μL，再向以上各孔均加入60 μL 酶結(jié)合物，震蕩混勻。每孔吸取100 μL轉(zhuǎn)移至包被板對應(yīng)孔內(nèi)。⑦溫育：置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育(30±1)min。⑧洗板：將各孔的液體棄入廢液筒，用(280±20)μL洗滌液洗滌板孔，共洗滌5次，每次洗滌后應(yīng)棄去孔內(nèi)的液體，最后1次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干。⑨加入底物：每孔各加入100 μL的魯米諾化學(xué)發(fā)光底物，振蕩混勻。⑩靜置：在15～25 ℃條件下避光靜置5 min，靜置后15 min內(nèi)用化學(xué)發(fā)光儀讀取發(fā)光值。

結(jié)果計算方法：以校準(zhǔn)品1至校準(zhǔn)品6的發(fā)光值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的抗體劑量值(0、10、20、50、100、200 NCU/mL)為橫坐標(biāo)，通過ELISACalc軟件繪制校準(zhǔn)品的四參數(shù)擬合曲線，四參數(shù)模式為Y=(a-b)/[1+(x/c)*b]+d。將樣本的發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線計算，即可得出樣品中抗體的含量。

1.5 試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定

將6個校準(zhǔn)品的發(fā)光值與對應(yīng)抗體劑量值進(jìn)行四參數(shù)擬合，R2≥0.99，試驗(yàn)成立;否則，試驗(yàn)不成立。如果待測樣品中抗體含量<臨界值40 NCU/mL，樣品應(yīng)判定為PPRV抗體陰性；如果樣品中抗體含量≥臨界值40 NCU/mL，則判定為PPRV抗體陽性。

1.6 質(zhì)控血清的檢測

采用化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法，對12份質(zhì)控血清(其中強(qiáng)陽性血清3份，陽性血清3份，弱陽性血清3份，陰性血清3份)進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，并用進(jìn)口的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒作為對照，比較2種檢測方法對質(zhì)控樣本的檢出率。

1.7 交叉試驗(yàn)

采用O型口蹄疫病毒陽性血清、羊痘病毒陽性血清、羊口瘡病毒陽性血清、布魯菌陽性血清和大腸桿菌陽性血清，進(jìn)行血清中和試驗(yàn)驗(yàn)證PPRV抗體為陰性后，用建立的化學(xué)發(fā)光方法對上述血清進(jìn)行檢測，判斷是否具有交叉反應(yīng)。

1.8 最低檢出量試驗(yàn)

將PPRV敏感性陽性質(zhì)控血清按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048進(jìn)行倍比稀釋，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法與進(jìn)口的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒同時對上述血清進(jìn)行檢測，重復(fù)3次。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

采用建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法對12份經(jīng)過鑒定的陽性血清在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測，平行測定5次，計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.10 符合性試驗(yàn)

采用建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法與進(jìn)口的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒對送檢的338份血清進(jìn)行檢測，計算其符合率。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，并計算變異系數(shù)。變異系數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)× 100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPRV單克隆抗體的制備與純化分析

SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在55與27 kDa處分別出現(xiàn)PPRV單克隆抗體重鏈與輕鏈的目的條帶，表明試驗(yàn)成功制備了針對PPRV的單克隆抗體，且純化后的單克隆抗體純度在90%以上，結(jié)果見圖1。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PPRV單克隆抗體(小鼠腹水)

2.2 質(zhì)控血清檢測

采用化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法，對12份質(zhì)控血清進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，檢測結(jié)果顯示該檢測方法的3次重復(fù)試驗(yàn)和進(jìn)口檢測試劑盒的陽性檢出率均為100%，見表1。

表1 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法對質(zhì)控血清的檢測結(jié)果

2.3 交叉試驗(yàn)

用建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法對交叉試驗(yàn)對照血清進(jìn)行檢測，結(jié)果全部為陰性，見表2。

表2 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法交叉試驗(yàn)

2.4 最低檢出量試驗(yàn)

將陽性質(zhì)控血清進(jìn)行倍比稀釋，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法對上述血清進(jìn)行檢測。結(jié)果表明進(jìn)口PPRV ELISA抗體檢測試劑盒對陽性質(zhì)控血清檢測最低稀釋度為1∶512，化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測試劑盒最低檢出量為1∶1 024，說明該檢測方法的敏感性優(yōu)于進(jìn)口ELISA檢測方法。結(jié)果見表3。

表3 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法最低檢出量試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

采用建立的快速定量檢測方法對12份血清在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測，平行測定5次，計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的化學(xué)發(fā)光方法批內(nèi)重復(fù)系數(shù)均小于10%，批間重復(fù)系數(shù)均小于15%，該方法具有良好的重復(fù)性。結(jié)果詳見表4。

表4 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 符合性試驗(yàn)

選擇抽取338份樣本，使用本研究建立的PPRV抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法與進(jìn)口的PPRV ELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行比對。檢測結(jié)果顯示，2種方法的總符合率為90.33%，陽性符合率為95.02%，陰性符合率為82.08%。結(jié)果見表5。

表5 符合率統(tǒng)計

3 討論

PPRV感染能力強(qiáng)，傳播途徑多，其引起的PPR在多個國家和地區(qū)發(fā)生過大范圍流行，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。該病一旦發(fā)生，會給養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)造成重大損失，因而及時快速診斷十分重要[1,5]。目前我國現(xiàn)有的PPRV檢測國標(biāo)《小反芻獸疫診斷技術(shù)》(GB/T 27982-2011)主要涉及PPRV的分離鑒定、血清中和試驗(yàn)、病毒核酸的分子生物學(xué)檢測方法以及病毒抗體的ELISA檢測方法[5-6]。但病毒分離鑒定、血清中和試驗(yàn)、病毒核酸的分子生物學(xué)檢測方法的局限性在于對實(shí)驗(yàn)室條件和人員操作水平有較高的要求，檢測速度相對較慢。在血清學(xué)檢測方面，ELISA方法作為傳統(tǒng)的檢測技術(shù)之一，各級實(shí)驗(yàn)室普及性較高，但檢測穩(wěn)定性與特異性具有一定的局限性。近年來國內(nèi)外學(xué)者依據(jù)病毒的N、H和F等特異保守抗原建立了多種ELISA檢測技術(shù)，例如C-ELISA、I-ELISA等檢測方法，在敏感性與特異性方面取得了一些進(jìn)展[9-11]。而化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法與傳統(tǒng)ELISA對比，兩者操作步驟、檢測速度相近，但化學(xué)發(fā)光方法的優(yōu)越之處在于發(fā)光底物的靈敏性更好[12]。在人類醫(yī)學(xué)診斷檢測方面，已經(jīng)成功建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法用于檢測乙肝病毒感染標(biāo)志物等多項(xiàng)成熟的技術(shù)，無論檢測的敏感性與特異性都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)ELISA方法[13]。

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。該方法將抗原、抗體同樣本結(jié)合，而有的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法由磁珠捕捉形成反應(yīng)物，然后再加入發(fā)光促進(jìn)劑，加大反應(yīng)物自發(fā)光速度和強(qiáng)度，用發(fā)光信號測量儀測量光子數(shù)量進(jìn)行定量分析?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法是繼放免分析、傳統(tǒng)酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的又一項(xiàng)新型的酶免疫分析檢測技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光方法精確度高，無污染，檢測速度快，技術(shù)日益成熟，代表了免疫診斷的發(fā)展方向[14]。目前尚沒有敏感性與特異性更高的PPRV抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法見于國內(nèi)外文獻(xiàn)報道之中。本研究使用了PPRV N蛋白作為包被抗原，純化并標(biāo)記針對N抗原的單克隆抗體建立了PPRV抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法。與市售的PPRV抗體ELISA檢測試劑盒相比，本研究建立的化學(xué)發(fā)光檢測方法，在保證檢測特異性的同時，靈敏度方面比市售ELISA試劑盒更為敏感，陽性血清樣品檢出率也更高，并且可以實(shí)現(xiàn)抗體的定量檢測，所以檢測性能方面更具優(yōu)勢，具有較好的市場應(yīng)用前景。

綜上，本研究建立的PPRV抗體化學(xué)發(fā)光檢測方法敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡單、快速，適用于基層各級獸醫(yī)部門和出入境檢驗(yàn)檢疫局對PPRV血清抗體的快速定量檢測，為PPR的防控和凈化提供了重要技術(shù)手段。