五大連池天然露頭泉水源地嗜鐵細(xì)菌的分離鑒定

劉 威，王菁華，潘 虹，孫義敏，王 松，李月興，郭新明

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱150040）

五大連池隸屬黑龍江省黑河市，位于小興安嶺以及松嫩平原交匯地帶，具有寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候特征[1]。此礦泉水區(qū)域內(nèi)富含第四系玄武巖潛水，主要為次生礦水，來源并儲存在嫩江組下伏的石炭系額頭山組片巖、板巖及海西期花崗閃長巖中的原生礦水，沿斷裂并垂直向上含水層排泄為主，在局部地段白堊系含水層中形成次生礦水層，在水頭壓力下向東、東南方向運(yùn)移，沿南北向張扭性斷裂，以泉的形式排出地表，即南飲泉和北飲泉[2]。五大連池重碳酸礦泉水含有多種微量元素[3]，水中鐵離子主要以二價鐵離子的形態(tài)存在，此價態(tài)易于人體吸收，是天然的、理想的鐵離子優(yōu)質(zhì)保健飲品，在醫(yī)療保健方面作用明顯[4-6]。

微生物在低鐵條件下可合成的一類具有小分子量的、能特異地螯合Fe3+特點(diǎn)的螯合因子，為嗜鐵素，應(yīng)用于醫(yī)藥、生物防治方面越來越受到重視[7]。微生物分泌的嗜鐵素能活化土壤中的難溶性鐵離子，提高鐵元素的溶解性和移動性，進(jìn)而提高土壤中鐵元素的生物利用度[8-10]。大量研究表明，嗜鐵素在植物病害防治和促進(jìn)植物生長方面均起著重要的作用[11-15]。嗜鐵素除了在生物防治方面的應(yīng)用越來越多外，還廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域[16]。研究人員將藥物與嗜鐵素通過物理或者化學(xué)方法結(jié)合起來，形成鐵—嗜鐵素—連接體—藥物的復(fù)合物。然后利用微生物特異的鐵—嗜鐵素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將復(fù)合物定向轉(zhuǎn)移到病原菌細(xì)胞內(nèi)，從而像單克隆抗體一樣具有靶向作用功能，它可以有效的規(guī)避病原菌微生物的耐藥性問題[17]。

涌出地面數(shù)小時后的天然礦泉水中二氧化碳大量逸失，溶解氧含量增加，導(dǎo)致二價鐵離子迅速氧化。故本研究嘗試從五大連池天然露頭泉水源地篩選分泌嗜鐵素的細(xì)菌，對菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化特性及16S rRNA 序列進(jìn)行鑒定，為所篩菌株的開發(fā)利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品：選取五大連池天然露頭泉附近共10 個采樣點(diǎn)，采集樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基。CAS 檢測平板[18]。

1.1.3 主要試劑。生理生化試劑盒（海博）；Biospin Bacteria Genomic DNAExtraction Kit 試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PCR 擴(kuò)增的全套試劑購自大連寶生物工程有限公司；16S rRNA 序列擴(kuò)增引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；鉻天青成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜鐵素分泌細(xì)菌的分離與篩選。稱取各樣本1g，加入 100mL 的 LB 培養(yǎng)液中，在 28℃培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速200r/min。對培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，最后 3 個稀釋度（10-5～10-7）各取 100μL，各稀釋度做 3個重復(fù)。采用CAS 檢測平板法，28℃恒溫培養(yǎng)5d，觀察培養(yǎng)皿菌落生長情況及橘黃色螯合圈的產(chǎn)生。將各單菌落在CAS 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離并純化，根據(jù)橘黃色菌圈的大小篩選產(chǎn)嗜鐵素能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.2 菌種鑒定。形態(tài)觀察：將所篩細(xì)菌進(jìn)行菌落及菌體形態(tài)觀察，鑒定依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行。生理生化鑒定：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第九版》。分子鑒定：16S rRNA 基因的序列分析：將待測的菌種轉(zhuǎn)接于TSB 斜面培養(yǎng)基，待菌種生長成熟后轉(zhuǎn)接于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫，250rpm 震蕩培養(yǎng)3～7d。離心收集菌體，用無菌水洗滌3 次后置于4℃保存、備用。提取基因組DNA，利用上述提取的基因組DNA 作為 16S rRNA 基因組PCR 擴(kuò)增的模板，16S 通用引物為27F 和1492R，然后進(jìn)行膠回收PCR 產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證。PCR 回收產(chǎn)物與pMD-18T連接后放入16℃水浴中連接3h 左右，轉(zhuǎn)化DH5a 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；分別提取質(zhì)粒然后PCR（方法同上），瓊脂糖凝膠電泳驗證是否為陽性克隆，并送至測序公司測序。將測序結(jié)果在NCBI 上，經(jīng)BLAST 軟件與已知的16S rRNA 序列進(jìn)行相似性分析，選取近源模式種用ClustX 1.81 軟件進(jìn)行多序列比對。在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，選定其中同源性較高的相關(guān)菌株， 用 MAGE 7.0 軟件以Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

從10 個采樣點(diǎn)中利用CAS 檢測平板法初篩獲得19 株產(chǎn)嗜鐵素細(xì)菌。CAS 瓊脂培養(yǎng)基中因含有CAS、十六烷基銨（HDTMA）及Fe3+的三元復(fù)合物而呈藍(lán)色。當(dāng)更強(qiáng)的螯合劑將鐵從該復(fù)合物中移出時，顏色會由藍(lán)色轉(zhuǎn)為橘黃色。挑取初篩平板上產(chǎn)生橘黃色暈圈的菌落（圖1 第一排三個平板）和不產(chǎn)生橘黃色暈圈的菌落（圖1 第2 排三個平板），如圖所示，挑取單菌落接種到CAS 固體平板上培養(yǎng)后，目標(biāo)菌落在CAS 平板上產(chǎn)生明顯的橘黃色暈圈，而沒有產(chǎn)嗜鐵素細(xì)菌的采樣點(diǎn)不產(chǎn)生橘黃色暈圈。

2.2 菌株產(chǎn)嗜鐵素能力的定性檢測

對19 株初篩菌株利用點(diǎn)接培養(yǎng)對產(chǎn)嗜鐵素的能力進(jìn)行定性檢測，平板上均出現(xiàn)明顯的橘黃色暈圈，說明所篩菌株均具有較強(qiáng)的產(chǎn)嗜鐵素能力。選取兩株產(chǎn)橘黃色菌圈明顯的菌株2-12、3-4，2-12 號較3-4號菌產(chǎn)橘黃色菌圈直徑大，如圖2 所示，說明2-12 號菌產(chǎn)嗜鐵素能力更強(qiáng)。

2.3 嗜鐵素分泌細(xì)菌的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)觀察結(jié)果。篩選出的19 株嗜鐵素分泌菌的染色、形態(tài)和培養(yǎng)特征：均為革蘭氏陰性桿菌，大小在 0.5～0.8μm×1.5～3.0μm 間，1～4 根極生鞭毛，有莢膜，運(yùn)動，無芽孢。在KMB 平板上，三類菌株菌落圓形隆起，邊緣整齊，濕潤，粘稠，易挑起，菌落初期透明，后期膿狀樣，菌落較大且顯現(xiàn)不同程度的黃色。

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果。依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》可確認(rèn)篩選出的19 株嗜鐵素分泌菌均為假單胞菌屬細(xì)菌（Pseudo-monas spp.）。不同菌株生理生化特征如表1 所示，各分離菌株符合假單胞菌的基本特征，在甲基紅試驗和V-P 試驗中均呈陰性，不水解淀粉、乳糖，能還原硝酸鹽，均具有氧化酶、雙水解酶、精氨酸、過氧化氫酶活性，不產(chǎn)生吲哚和H2S，能在4℃低溫生長。這與相關(guān)文獻(xiàn)報道相符[19，20]。

2.3.3 16S rRNA 基因的序列分析。分離菌株在NCBI上經(jīng)BLAST 分析，結(jié)果表明各菌株均屬于假單胞菌屬，分別與 Pseudomonas qingdaonensis、Pseudomonas donghuensis 和Pseudomonas protegens 具有最高相似性，序列相似性均大于99%。將測定的假單胞菌16S rRNA序列測定的結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，選定同源性較高的相關(guān)菌株，以Neighbor-Joining 方法用MAGE 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到相應(yīng)的分類學(xué)上的地位。16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖3，系統(tǒng)發(fā)育樹共有3 個分枝，代表有3 個類群，其中類群Ⅰ有12 個菌株，類群Ⅱ有2 個菌株，類群Ⅲ有5 個菌株，各類群之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 產(chǎn)嗜鐵素細(xì)菌的分離篩選

圖2 嗜鐵素分泌菌2-12、3-4 嗜鐵能力的定性檢測

表1 生理生化特性

圖3 根據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

本研究共得到19 株具有分泌嗜鐵素功能的細(xì)菌，根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，各菌株均為假單胞菌屬，分別與Pseudomonas qingdaonensis、Pseudomonas donghuensis 和Pseudomonas protegens 具有最高相似性，序列相似性均大于99%。對19 株初篩菌株利用點(diǎn)接培養(yǎng)對其產(chǎn)嗜鐵素能力進(jìn)行定性檢測，平板上均出現(xiàn)明顯的橘黃色暈圈，具有較強(qiáng)的產(chǎn)嗜鐵素能力，選取兩株產(chǎn)橘黃色菌圈明顯的菌株 2-12、3-4，2-12 號較 3-4 號菌產(chǎn)橘黃色菌圈直徑大，2-12 號菌產(chǎn)嗜鐵素能力更強(qiáng)。

五大連池南泉礦泉水自然涌出的溫度接近于4℃，水中的Fe 主要以Fe2+形式存在，涌出地面數(shù)小時后的天然礦泉水中溶解的二氧化碳?xì)怏w大量逸失，溶解氧含量增加，二價鐵離子迅速氧化為三價鐵，最終變成氧化鐵沉淀。水源地篩選的嗜鐵素分泌菌為礦泉水開發(fā)中的利用提供了理論依據(jù)與技術(shù)支持。