固定時(shí)間的動(dòng)員方案與外周血造血干細(xì)胞分布規(guī)律分析＊

陳妙嬋，蔡葵，吳敏華，陳活強(qiáng)，劉棋楓

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院輸血科，佛山 528000)

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic peripheral blood stem cell transplantation，allo- PBSCT)是指通過血細(xì)胞單采技術(shù)從供者體內(nèi)獲取外周血造血干細(xì)胞來進(jìn)行的移植[1]。 外周血干細(xì)胞采集的數(shù)量直接決定移植的成敗。 生理情況下供者外周血干細(xì)胞約占單個(gè)核細(xì)胞0.01%-0.1%, 難以滿足外周血干細(xì)胞移植的需求[2]。 CD34+細(xì)胞少于0.05,需要?jiǎng)訂T使CD34+細(xì)胞增加后通過血細(xì)胞分離造血干細(xì)胞,部分供者通過常規(guī)手段無法獲得足夠造血干細(xì)胞, 采集前白細(xì)胞計(jì)數(shù)與外周血干細(xì)胞數(shù)、CD34+細(xì)胞數(shù)有一定相關(guān)性， 表明外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)可作為預(yù)測采集物CD34+細(xì)胞數(shù)量的良好指標(biāo)[3-5]。 目前國內(nèi)對(duì)供者外周血干細(xì)胞采集影響因素的研究報(bào)道多傾向于年齡、性別、注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的劑量等， 而分析動(dòng)員方案與外周血造血干細(xì)胞分布規(guī)律方面的文獻(xiàn)報(bào)道少見，本文通過回顧性分析固定時(shí)間的動(dòng)員方案與非固定時(shí)間的動(dòng)員方案干細(xì)胞產(chǎn)品的采集效率，探討動(dòng)員方案外周血的 WBC、MNC、CD34+細(xì)胞的分布規(guī)律， 擬制定干細(xì)胞采集最佳時(shí)機(jī)的臨床路徑，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016-2019 年在我院行異體PBSC（peripheral blood stem cell 造血干細(xì)胞）采集的健康供者 40 例, 其中男 21 例， 女 19 例； 年齡11-58 歲，中位年齡 31 歲；身高 152-178cm，中位身高167cm；體重54-89kg，中位體重66kg；所有健康供者均接受術(shù)前檢查：包括梅毒、艾滋、乙肝、丙肝等免疫學(xué)檢測指標(biāo)正常，肝腎功能、生化電解質(zhì)，凝血功能正常，無重要器官功能障礙，所有健康供者術(shù)前充分溝通知曉方案并簽儲(chǔ)知情同意書。

1.2 主要儀器 Baxter CS-3000plus（Baxter，美國），SysmexXE－2100 型血細(xì)胞分析儀，流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國）

1.3 PBSC 動(dòng)員方案

1.3.1 方案1 固定時(shí)間的動(dòng)員方案25 例，于單采前5 天開始給供者皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子( rhG-CSF)10μg/（kg·d），每 12 h 一次，采用8：00、20：00 各一次。

1.3.2 方案2 非固定時(shí)間的動(dòng)員方案15 例，于單采前5 天開始給供者皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子( rhG-CSF)10μg/（kg·d），2 次/d，藥量同方案1，給藥時(shí)間2 次/d，早上、下午各注射一次。

1.4 PBSC 產(chǎn)品采集

1.4.1 方案1 健康供者動(dòng)員第5 天用CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)采集PBSC。 供者于動(dòng)員后第4 天采多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的外周血， 即 8：00、9：00、10：00、12：00、15：00、18：00，監(jiān)測 25 例健康供者其外周血的血常規(guī)以及CD34+細(xì)胞比例。 取上述不同時(shí)間點(diǎn)的外周血檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)（MNC）與CD34+細(xì)胞數(shù)等數(shù)據(jù)繪制分布規(guī)律曲線圖。 根據(jù)第4 天繪制分布規(guī)律圖，第5 天取次高峰與高峰期在10:00-15:00 期間共300min 進(jìn)行外周血干細(xì)胞采集，循環(huán)血量10000-15000ml（中位數(shù)為 12500），流速為 30-60ml/min，以 ACD 液為抗凝劑，取采集物少量稀釋后計(jì)算MNC 和CD34+細(xì)胞，計(jì)算供者產(chǎn)品的細(xì)胞總量。

1.4.2 方案2 健康供者按臨床現(xiàn)行上午、 下午各動(dòng)員一次的慣例，于動(dòng)員第5 天上午注射rhG-CSF 1h 后開始采集外周血干細(xì)胞共300min，循環(huán)血量10000-15000ml(中位數(shù)為12500),流速為30-60ml/min，以ACD 液為抗凝劑，取采集物少量稀釋后計(jì)算MNC 和CD34+細(xì)胞比例，計(jì)算供者產(chǎn)品的細(xì)胞總量。

1.4.3 根據(jù)干細(xì)胞不同動(dòng)員方案采集有效率比較，制定臨床動(dòng)員方案及采集最佳時(shí)機(jī)的臨床路徑。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 軟件，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用確切概率法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

40 例健康供者納入動(dòng)員方案檢測范疇， 所有采集干細(xì)胞產(chǎn)品均進(jìn)入結(jié)果分析。 固定時(shí)間的動(dòng)員方案中25 例健康供者，動(dòng)員后第4 天所取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的WBC、 外周血MNC、CD34+細(xì)胞比例的中位數(shù)等數(shù)據(jù)繪制趨勢(shì)曲線圖（圖1、2、3）。不同性別的健康供者PBSC 動(dòng)員后干細(xì)胞的分布規(guī)律比較見表1，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 不同動(dòng)員方案采集的供者干細(xì)胞數(shù)據(jù)比較見表2。不同動(dòng)員方案采集有效率比較見表3。

圖1 固定時(shí)間的動(dòng)員方案健康供者WBC 的分布規(guī)律

圖2 固定時(shí)間的動(dòng)員方案健康供者外周血MNC 的分布規(guī)律

圖3 固定時(shí)間的動(dòng)員方案健康供者CD34+比例的分布規(guī)律

表1 不同性別的健康供者PBSC 動(dòng)員后干細(xì)胞數(shù)據(jù)比較(±s)

表1 不同性別的健康供者PBSC 動(dòng)員后干細(xì)胞數(shù)據(jù)比較(±s)

性別 n 外周血單個(gè)核細(xì)胞（×109/L） 外周血CD34+（106/kg）男女P 21 19＞0.05 7.93±2.04 7.51±1.96＞0.05 6.32±1.94 5.98±1.52＞0.05

3 討論

表2 不同動(dòng)員方案采集的供者干細(xì)胞數(shù)據(jù)比較(±s)

表2 不同動(dòng)員方案采集的供者干細(xì)胞數(shù)據(jù)比較(±s)

動(dòng)員方案 n 產(chǎn)品外周血單個(gè)核細(xì)胞（×109/L）產(chǎn)品CD34+（106/kg）方案一方案二產(chǎn)品MNC（108/kg）25 15 t P 7.02±2.04 4.21±1.05 4.06<0.01 7.02±2.17 2.28±1.05 6.47<0.01 4.68±1.94 0.70±0.52 6.31<0.01

表3 不同動(dòng)員方案采集有效率比較

急性髓系白血病是起原于干、 祖細(xì)胞的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性，異基因造血干細(xì)胞移植是目前唯一可能治愈急性白血病的手段[6,7]。有效的動(dòng)員既可以最大限度保障健康供者的利益，又能提高外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集效率，把握最佳采集時(shí)機(jī)非常關(guān)鍵。 通常認(rèn)為，外周血干細(xì)胞MNC 達(dá)(4-8)×108/kg 以上、CD34+細(xì)胞達(dá)(4-6)×106/kg 以上是用于異基因移植的最佳劑量[8]。本研究動(dòng)員后PBSC 增長的高峰期通常在第4-6 天，在這期間采集干細(xì)胞產(chǎn)品就能獲得移植所需要的MNC和CD34+細(xì)胞,且在第5 天分離干細(xì)胞可以獲得最多的干細(xì)胞，最少量的T 細(xì)胞[9]。 以往臨床醫(yī)生在制定干細(xì)胞移植計(jì)劃時(shí)各有不同的動(dòng)員方案及采集時(shí)機(jī)，存在一定的隨機(jī)性，不能保證最終采集效率， 本研究采用固定時(shí)間的動(dòng)員方案rhG-CSF 10μg/（kg·d），每 12h 一次，并觀察動(dòng)員后第 4 天的WBC、 外周血MNC、CD34+細(xì)胞比例的分布規(guī)律，從圖1、2 可看出WBC、外周血MNC 數(shù)量隨著注射時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì)； 圖3 可見CD34+細(xì)胞比例在8:00 注射rhG-CSF1h 開始升高，4h 達(dá)到最高峰，5h 后呈下降趨勢(shì)，7h 后降至低水平，此時(shí)供者的WBC 與MNC 仍呈上升趨勢(shì)。 由此可得外周血MNC、CD34+細(xì)胞的變化程度不一， 但其變化趨勢(shì)有一定的規(guī)律， 當(dāng)給健康供者采用固定時(shí)間注射rhG-CSF 時(shí)，其外周血干細(xì)胞的分布具有可預(yù)測的規(guī)律。 本研究采用固定時(shí)間的造血干細(xì)胞動(dòng)員方案， 即供者皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子10μg/（kg·d），q12h（8：00、20：00 各一次），干細(xì)胞均在 12:00 達(dá)到峰值，10:00 至 15:00 為最佳采集時(shí)機(jī)。 通過分析固定時(shí)間的動(dòng)員方案與干細(xì)胞分布規(guī)律的關(guān)系， 制定干細(xì)胞采集最佳時(shí)機(jī)的臨床路徑， 固定時(shí)間的動(dòng)員方案與非固定時(shí)間的動(dòng)員方案對(duì)比， 產(chǎn)品MNC 采集效率提高208%， 產(chǎn)品CD34+采集效率提高569%。

臨床上往往通過觀察健康供者外周血MNC或者CD34+細(xì)胞數(shù)量， 來指導(dǎo)供者的采集次數(shù)與所需循環(huán)血量。白雯等[10]采用動(dòng)員方案為粒細(xì)胞集落刺激因子(G- CSF) 300μg/d 動(dòng)員 3d ，產(chǎn)品MNC與采前供者外周血MNC 呈正相關(guān), 產(chǎn)品CD34+細(xì)胞數(shù)與采前供者外周血MNC 呈正相關(guān)，提示采集干細(xì)胞產(chǎn)品前外周血中相對(duì)高的MNC 可使產(chǎn)品獲得較多 MNC 及 CD34+細(xì)胞。 從圖1、2、3 可見，自動(dòng)員方案開始實(shí)行后，WBC 與外周血MNC 總體呈上升的趨勢(shì)，分布規(guī)律圖符合白雯等的報(bào)道，而CD34+細(xì)胞則在 8:00 注射 rhG-CSF 后 1h 開始升高， 4h 達(dá)到最高峰，5h 后呈下降趨勢(shì)。因此我們認(rèn)為， 在指導(dǎo)選擇干細(xì)胞最佳采集時(shí)機(jī)方面， 觀察CD34+細(xì)胞比例的分布規(guī)律較外周血MNC 更為客觀。 方案一供者干細(xì)胞采集的最終產(chǎn)品量MNC 能一次性獲得達(dá)到最佳移植量， 超過80%產(chǎn)品CD34+能一次性獲得達(dá)到最佳移植量，可以滿足臨床干細(xì)胞移植所需， 而方案二均未能一次性獲得達(dá)到最佳移植量。

外周血干細(xì)胞移植的首要條件是造血干細(xì)胞有效動(dòng)員和采集,并能較快持久地重建造血。 近年國內(nèi)外不少單位已開展了此項(xiàng)工作， 但平均每例供者采集次數(shù)較多,且造血干細(xì)胞的采集效率高低差別較大[11]。PBSC 供者動(dòng)員方案多樣，多是每天注射rhG-CSF 兩次，沒有明確規(guī)定間隔時(shí)間，無干細(xì)胞動(dòng)員的規(guī)律依據(jù)[12,13]。 本課題所選擇的供者年齡范圍廣， 性別不同等因素均不會(huì)對(duì)動(dòng)員后干細(xì)胞的分布規(guī)律有明顯的影響。 我們認(rèn)為，固定時(shí)間的動(dòng)員方案可獲得預(yù)期的干細(xì)胞分布規(guī)律， 從而可制定干細(xì)胞采集最佳時(shí)機(jī)的臨床路徑， 獲得較高的采集效率。 本研究所采用的供者皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)10μg /(kg·d），每12h 一次，即 8：00、20：00 各一次的動(dòng)員方案，采集時(shí)機(jī)為9:00 至14:00，能一次獲得足夠治療量的造血干細(xì)胞，減少了采集所需要的時(shí)間和次數(shù)，極大的減輕了供者的痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)， 對(duì)外周血干細(xì)胞移植有著重要的指導(dǎo)意義。