痘苗病毒致炎兔皮提取物對腦缺血再灌注腦損傷大鼠凋亡和神經(jīng)炎癥的影響

陳小平，王明洋，馬登磊，龔詩立，張麗，李雅莉，李林，胡朝英，張?zhí)m

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥學部，國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京市100053

缺血性腦卒中是一種復雜的腦血管疾病，是目前危害人類健康的主要疾病之一[1]。中國是腦卒中發(fā)病率最高的國家之一[2]。缺血性腦卒中涉及多個病理過程，如炎癥反應、細胞凋亡、興奮性毒性和氧化應激等。其中細胞凋亡導致神經(jīng)元數(shù)量減少，大腦功能受損[3?4]；在腦組織恢復血流灌注時，也將產(chǎn)生過多的活性物質(zhì)和炎癥因子，引發(fā)炎癥反應，加劇梗死中心損傷，并導致腦缺血再灌注損傷[5?7]。通過抑制炎癥誘導的細胞凋亡，對該病治療有重要意義。

痘苗病毒致炎兔皮提取物(analgecine,AGC)是從牛痘病毒致炎的日本大耳白兔皮膚提取的一種生物活性制劑，含有多種多肽、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)[8]，用于頸肩腕綜合征[9]、腰痛[10]、冷感、麻木等癥狀的緩解和癥狀性神經(jīng)痛[11]，臨床應用已近70 年[12]。最近研究表明，AGC 有抗炎鎮(zhèn)痛[12]、神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用[13?14]。本研究采用Sprague?Dawley 大鼠大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型，探索AGC的治療作用以及其可能的藥理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級Sprague?Dawley大鼠61只，體質(zhì)量260～300 g，購自維通利華有限公司，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室屏障樓，室溫20～24 ℃，濕度50%～70%，12 h光照，自由進食、進水。

所有操作符合保護動物福利倫理標準。

1.2 主要試劑和儀器

AGC：批號Y20180505，威世藥業(yè)(如皋)有限公司。MCAO 線栓：西濃公司。熱休克蛋白70 (heat shock proteins 70,HSP70)和Bcl?2 一 抗：ABCAM 公司。Bax 一抗：CST 公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、離子鈣結合蛋白(ion?ized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)、二步法檢測試劑盒、一抗山羊血清(貨號ZLI?9021)、DAB 顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。乙二醇：上海麥克林生化科技有限公司。丙三醇：北京化工廠有限責任公司。

BH?2光學顯微鏡： 日本OLYMPUS公司。BS210S 電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。CM1950冰凍切片機：德國LECIA公司。

1.3 動物分組、造模和給藥

大鼠分為假手術組11 只，假手術給藥組11 只，模型組20只和模型給藥組19只。

模型組和模型給藥組稱重后，10%水合氯醛3.3～3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定，備皮，頸部正中切口，分離右頸總動脈；于頸總動脈分叉處插入線拴至大腦前動脈近端，結扎大腦中動脈，并用黑色記號筆在線栓上標記；固定線栓和頸內(nèi)動脈，縫合切口。假手術組和假手術給藥組分離右頸總動脈后直接縫合切口。

大鼠術后置于放有棉花的鼠籠中保溫，1.5 h后拔出線栓，解開結扎手術線。大鼠清醒后出現(xiàn)左側肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時向一側轉圈，判定為造模成功。模型組和模型給藥組各有2 只造模不成功，予以剔除。

再灌注3 h 后，各給藥組尾靜脈注射AGC 20 U/kg，假手術組和模型組尾靜脈注射等體積生理鹽水，以后每天1 次。再灌注48 h 后，每組4 只大鼠取材，其余繼續(xù)給藥至第7天。

1.4 抓握牽引實驗[15]

給藥第7 天，在距離地面40 cm 左右放置直徑1 mm、長60 cm的鋼絲繩，鋼絲繩下放置泡沫墊避免跌傷。將大鼠前爪置于鋼絲繩上，記錄松手后至大鼠跌落的時間。評分標準：0 分，無法抓握；1 分，抓握≤10 s；2 分，10 ＜～20 s；3 分，20 ＜～30 s；4 分：30 ＜～60 s；5分，60 ＜～90 s；6分，90 ＜～120 s。

1.5 Western blotting

再灌注48 h，每組取4只，同法麻醉，斷頭取腦。冰上分離左右皮質(zhì)，凍存管中液氮凍存，儲存于-80 ℃冰箱。提取各組皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)組織蛋白，BCA 定量，等體積加入5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃5 min 備用或-20 ℃儲存。蛋白樣本電泳、電轉，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，加入HSP70 (1∶1000)、Bcl?2(1∶1000)、Bax(1∶1000)和β?actin(1∶2000)一抗，4 ℃過夜。TBST洗3次，加入辣根酶標記山羊抗兔IgG (1∶2000)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG (1∶2000)二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗3 次。暗室內(nèi)滴加發(fā)光液，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析目標條帶凈光密度值，用AlphaView SA 軟件計算目的蛋白條帶灰度值，并計算與β?actin的比值。

1.6 免疫組化染色

完成抓握牽引實驗后，每組取4 只大鼠，同法麻醉，開胸，完全暴露心臟，注射器針頭插入左心室心尖，在心臟右心耳處剪一小口；緩慢推動注射器注入蒸餾水，待右心耳流出的液體不再有血液時，換4%多聚甲醛(pH=7.4)繼續(xù)灌注至大鼠四肢僵直。開顱取腦，4%多聚甲醛固定，4 ℃暫存；固定24 h后，冰凍切片，厚30 μm，凍存液(0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液∶乙二醇∶丙三醇=2∶1∶1)中-20 ℃儲存。

取出腦片，置PBS 中平衡30 min，自然冷卻至室溫，PBS 洗3 遍；3%H2O2室溫避光孵育10 min；PBS洗3 遍；滴加10%山羊血清封閉液37 ℃孵育1 h。加GFAP(1∶500)和Iba1 (1∶200)一抗，4 ℃過夜。PBS洗3 遍，滴加試劑2，37 ℃孵育20 min；PBS 洗3 遍，滴加試劑3，37 ℃孵育20 min；PBS 洗3 遍。DAB 顯色1 min，自來水終止；裱片，晾干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Image?J 軟件計算Iba1和GFAP陽性面積。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用()表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 抓握牽引實驗

與假手術組相比，模型組抓握牽引時間顯著降低(P＜0.001)；與模型組相比，模型給藥組抓握牽引時間明顯升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組抓握牽引實驗評分

2.2 Western blotting

模型組HSP70、Bcl?2 和Bcl?2/Bax 較假手術組降低(P＜0.05)，模型給藥組較模型組明顯升高(P＜0.01)。見圖1、表2。

2.3 免疫組化染色

圖1 各組皮質(zhì)Western blotting結果

假手術組和假手術給藥組星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞形態(tài)正常且分布均勻；模型組星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化明顯，且呈團塊狀分布，Iba1 和GFAP陽性面積顯著增加(P＜0.001)；與模型組相比，模型給藥組星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化程度明顯降低，GFAP 和Iba1 陽性面積均有所減少(P＜0.05)。見圖2、圖3、表3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷引起細胞凋亡、炎癥反應和神經(jīng)元變性，導致神經(jīng)功能損傷[16?17]。凋亡是神經(jīng)元丟失的主要原因之一，而星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞在腦缺血缺氧等刺激后被激活。我們前期研究顯示[18]，腦缺血再灌注損傷后第7 天，星形膠質(zhì)細胞仍處于激活狀態(tài)，引發(fā)神經(jīng)炎癥?；罨哪z質(zhì)細胞釋放大量促炎癥因子，進一步激活下游炎癥信號通路，導致炎癥發(fā)生，最終導致腦損傷[19?21]。

腦缺血再灌注損傷后出現(xiàn)細胞凋亡，大量神經(jīng)元損傷[22]。Bcl?2 蛋白家族包括Bax 等促凋亡蛋白和Bcl?2 等抗凋亡蛋白，二者比例決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡[23]。Bcl?2 通過穩(wěn)定線粒體膜電位、抑制氧自由基產(chǎn)生、抑制Ca2+內(nèi)流、阻止p53 基因表達產(chǎn)物進入胞核等多種途徑，抑制細胞凋亡發(fā)生[24?26]。再灌注24～48 h時凋亡最嚴重，是研究抗凋亡藥物的理想時段[18]。本研究顯示，缺血再灌注損傷后48 h，AGC 能顯著增加MCAO 大鼠腦內(nèi)Bcl?2 蛋白表達，使Bcl?2/Bax 比例增高，從而抑制細胞凋亡，減少損傷，維持神經(jīng)元正常功能。

表2 各組HSP70、Bcl-2和Bax表達

圖2 各組皮質(zhì)GFAP表達(免疫組化染色,×200)

圖3 各組皮質(zhì)Iba1表達(免疫組化染色,×200)

表3 各組GFAP和Iba1陽性面積(%)

HSP70 是一種細胞保護蛋白。細胞受到外源性刺激時，可通過分泌HSP70，提高細胞抵抗力[27]。HSP70 還可增加Bcl?2 的表達，對缺血性腦損傷起保護作用[28?29]。本研究顯示，AGC 能促進MCAO 大鼠HSP70 分泌，抵抗腦損傷；還可通過調(diào)控Bcl?2 蛋白的表達，間接抑制細胞凋亡。

Iba1 是小膠質(zhì)細胞標記物。小膠質(zhì)細胞活化釋放許多細胞因子、補體和炎性介質(zhì)[30]。GFAP 在星形膠質(zhì)細胞特異性表達[31]。在腦缺血后，活化的小膠質(zhì)細胞誘導神經(jīng)毒性反應性星形膠質(zhì)細胞活化，引發(fā)神經(jīng)炎癥，導致神經(jīng)損傷，引起神經(jīng)元死亡[19,32]。星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化后，釋放細胞因子，活化單核巨噬細胞，對神經(jīng)元有較強的細胞毒性，使神經(jīng)元細胞凋亡機制不可逆啟動，從而加重腦缺血區(qū)損傷[33?34]。本研究顯示，AGC 可通過抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化，抑制腦缺血再灌注后炎癥反應，進一步減少腦損傷。

綜上所述，本研究顯示，AGC可促進腦缺血再灌注大鼠運動功能恢復，對缺血再灌注損傷有較好的保護作用，可能涉及抑制細胞凋亡和神經(jīng)炎癥。AGC對星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化的抑制作用，為進一步研究AGC抗炎作用機制提供基礎。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。