CRISPR/Cas技術(shù)實(shí)現(xiàn)擬南芥中染色體結(jié)構(gòu)的改變（2020.9.5 Plant Biotechnology Journal）

每個(gè)生物體中遺傳信息的變異性是生態(tài)系統(tǒng)中廣泛生物多樣性的基礎(chǔ)。除了簡(jiǎn)單的突變導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)堿基的改變外，在不同物種的進(jìn)化過程中還可以反復(fù)觀察到染色體結(jié)構(gòu)的變化。特別是染色體片段方向的改變（例如倒位），與物種形成、適應(yīng)和基因組進(jìn)化有關(guān)。染色體倒位是在不同的植物分離株或品種之間反復(fù)發(fā)生的重排。這種倒位可能是進(jìn)化中生殖隔離的基礎(chǔ)，也是經(jīng)典育種的一個(gè)主要障礙，因?yàn)樵谕慈旧w上的倒位序列之間無法觀察到交叉（crossovers，COs）。

近日，德國(guó)卡爾斯魯厄理工學(xué)院的Holger Puchta團(tuán)隊(duì)在Nature Communications上發(fā)表了題為“Changing local recombination patterns in Arabidopsis by CRISPR/Cas mediated chromosome engineering”的研究成果，描述了Col-0中hk4S倒位的逆轉(zhuǎn)，并利用來自金黃色葡萄球菌的高效Cas9核酸酶在各自區(qū)域的品種之間恢復(fù)CO。

通過比較兩個(gè)擬南芥生態(tài)型Columbia（Col-0）和Landsberg errecta（Ler-1）的基因組序列，可以檢測(cè)到許多倒位。其中最著名的是hk4S倒位，大小為1.17Mb，導(dǎo)致著絲粒異染色質(zhì)knob區(qū)域轉(zhuǎn)移至4號(hào)染色體短臂的中間。而Ler-1中的4號(hào)染色體代表進(jìn)化較早的構(gòu)象，Col-0對(duì)應(yīng)的4號(hào)染色體帶有hk4S倒位。

首先，作者利用現(xiàn)有的序列信息識(shí)別了合適的原間隔序列，這些序列位于兩個(gè)原始反轉(zhuǎn)結(jié)附近。此外，為了避免周圍基因的干擾，確保了所選的原間隔區(qū)位于基因間區(qū)域（根據(jù)其對(duì)著絲粒的定位，命名為近端原間隔區(qū)（p PS）和遠(yuǎn)端原間隔區(qū)（d PS））。所用的兩個(gè)原間隔區(qū)都被放置在靠近原始hk4S d結(jié)的kb范圍內(nèi)。在卵細(xì)胞特異性EC1.1/EC1.2啟動(dòng)子的控制下，用Sa-Cas9克隆到pDe-Sa-Cas9載體中，最終轉(zhuǎn)化為A.thaliana Col-0野生型植物。并通過對(duì)38個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化子代的篩選，作者獲得了7個(gè)獨(dú)立的Mb大小的倒位事件，總的頻率約為0.5%，成功地實(shí)現(xiàn)了hk4S knob的倒轉(zhuǎn)。

接下來，作者測(cè)試了是否能夠通過CRISPR/Cas誘導(dǎo)的hk4S knob倒位來重新激活與Ler-1雜交的先前CO區(qū)的重組。作者將Ler-1與rknob-1雜交，并用Col-0野生型植物與Ler-1雜交作為對(duì)照。重組頻率利用SNP的基因分型，通過使用七個(gè)標(biāo)記來區(qū)分Col-0和Ler-1來確定。標(biāo)記2和標(biāo)記6位于倒位的外部，但直接靠近倒位連接處，距離只有幾百個(gè)堿基對(duì)，代表倒位的兩個(gè)邊界。

首先，作者分析了倒位區(qū)的單倍體花粉。在開花期收集雜種F1的花序，通過流式細(xì)胞儀分離花粉核，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。作為質(zhì)量控制，作者檢測(cè)了3個(gè)不同區(qū)域是否存在SNP標(biāo)記，以識(shí)別成功擴(kuò)增的花粉DNA。然后，確定了5個(gè)間隔的CO頻率。在倒位線的54個(gè)樣本（rknob-1×Ler-1）中，作者檢測(cè)到3個(gè)均勻分布在倒位區(qū)域上的獨(dú)立CO事件，而在90個(gè)對(duì)照樣本中，沒有在倒位區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到CO事件。為了證實(shí)后代的這些結(jié)果，作者利用SNP的基因分型測(cè)試了6株雜種F2植株的CO形成。用與F1分析相同的引物和探針對(duì)rknob-1×Ler-1系198株F2和對(duì)照組200株F2植株測(cè)定了CO。總體而言，作者在rknob-1×Ler-1系的染色體臂中檢測(cè)到9個(gè)CO事件，在倒位中檢測(cè)到27個(gè)CO事件，在著絲粒附近沒有CO事件。因此證明，通過恢復(fù)knob倒位，作者恢復(fù)了4號(hào)染色體先前不可接近部分的CO形成，并改變了重組模式。

本文研究表明，利用金黃色葡萄球菌中Cas9核酸酶的卵細(xì)胞特異性表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)1.1Mb長(zhǎng)hk4S倒位的靶向逆轉(zhuǎn)。通過將帶有重排的4號(hào)染色體的Col-0與Ler-1雜交，減數(shù)分裂交換可以恢復(fù)到以前沒有檢測(cè)到的遺傳交換的區(qū)域。昭示了打破遺傳連鎖的體細(xì)胞染色體工程策略在植物育種中具有巨大的應(yīng)用潛力。