正交試驗法優(yōu)選加減玉女煎的提取工藝

李 祥， 陳長勛， 鄭 冰

(上海中醫(yī)藥大學藥理教研室，上海 201203)

*通訊作者:陳長勛，男，教授。Tel:(021)51322200 E－mail:cxchen6@126.com。

加減玉女煎出自清代溫病大家吳瑭的《溫病條辨》，由生石膏、知母、玄參、細生地、麥冬五味藥物組成。方以甘寒藥物為主，清氣生津與涼營養(yǎng)陰并施，具有清熱涼血，養(yǎng)陰增液功效。

玄參、知母是方中兩味主要中藥，玄參中含環(huán)烯醚萜類成分哈巴苷和哈巴俄苷;知母含知母皂苷，屬甾體皂苷，兩類成分均溶于水。為了探討和優(yōu)化加減玉女煎最佳提取工藝，本文以水為溶媒，以干膏得率、玄參中哈巴俄苷(HAR)和知母中菝葜皂苷元(SAR)的煎出率為指標，采用正交試驗設計優(yōu)選加減玉女煎最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀;2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech);Aglient1200型高效液相色譜儀(Agilent 1200系列四元泵，Agilent 1200可變波長檢測器，Agilent工作站);HH－4恒溫水浴鍋(江蘇金壇市杰瑞爾電器);KUDOS－SK7200LH超聲儀(上?？茖С晝x器);FA－2004N 型電子天平、德國SartoriusCP225D型電子天平(上海中醫(yī)藥大學科學技術實驗中心)。

知母(購于上海市養(yǎng)和堂飲片廠，批號:090209);生地(上海市養(yǎng)和堂飲片廠，批號:090109);玄參(上海市康橋飲片有限公司，批號:090120);麥冬(購于上海市康橋飲片有限公司，批號:090114);石膏(購于上海市康橋飲片有限公司，批號:081205)。上述藥材，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學生藥學教研室趙志禮教授鑒定均為正品。

哈巴俄苷、菝葜皂苷元對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為:111730－200604 和 110744－200509);甲醇、氯仿、鹽酸、氫氧化鈉(AR，國藥集團)

2 方法與結果

2.1 提取工藝條件及考察方案 玄參、知母所含有效成分為環(huán)烯醚帖苷和甾體皂苷，采用水為溶媒。在預試驗的基礎上，考察浸泡時間、加水倍數(shù)、煎煮時間三個因素對提取效果的影響，本文選用L9(34)正交表安排正交試驗，以浸膏得率和哈巴俄苷、菝葜皂苷元的煎出率作為評價指標。

2.2 加減玉女煎吸水率實驗 稱取全方藥材總重的1/3(30 g)各3份，常溫下分別加10倍量水(25℃)浸泡，每30 min濾去表面水液后稱重一次，稱完后迅速再把藥材放入原水液中浸泡，記錄結果，直至吸水后的藥材重量變化不明顯為止。以時間為橫坐標，藥材濕重為縱坐標作圖，結果見圖1。實驗結果顯示，復方藥材在浸泡120 min時，基本達到最大吸水量，吸水率約為100%(1倍)。

圖1 復方藥材重量變化與浸泡時間關系

2.3 最佳煎煮次數(shù)的考察及提取方案 分別稱取全方總重的1/3(30 g)藥材兩份，各加10倍量水浸泡30 min后，煎煮1 h，濾過得一煎藥液;藥渣再加入10倍量水煎煮1 h，濾過得二煎藥液;藥渣再加入10倍量水煎煮1 h，濾過得三煎藥液;三次煎煮藥液分別濃縮，60℃減壓真空干燥，稱重。結果如下表1。

表1 兩次投料煎煮分別所得干膏重量

從以上結果可以看出，三煎干膏提取率已經(jīng)大大降低，從節(jié)約能源、降低成本等方面考慮，確定該復方的提取次數(shù)為兩次。根據(jù)上述單因素考察結果，設計正交提取方案見表2～3。

表2 加減玉女煎正交表頭設計L9(34)

2.4 樣品提取 稱取全方藥材九份(每份90 g，成人一天入湯劑的量)，按正交表頭設計進行試驗，復方先用武火約30～40 min煮沸，后改用文火保持微沸，微沸維持時間按表2所示。兩次煎液過濾合并，濃縮至適量，放冷轉移到100 mL量瓶中定容。

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表3 加減玉女煎水提正交試驗及結果

2.5 收膏率的測定 精密吸取各樣品濃縮液5 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60℃減壓真空干燥，置干燥器中冷卻，迅速稱重，計算干膏得率。

2.6 哈巴俄苷煎出率的測定［1］、［2］色譜條件:色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈－1%醋酸溶液線性梯度洗脫(20∶80→50∶50，20 min);流速:1 mL/min;檢測波長:278 nm;柱溫:25℃;在此色譜條件下理論塔板數(shù)按哈巴俄苷峰計算不低于5 000。

標準曲線的繪制:準確稱取干燥至恒重的哈巴俄苷對照品2.04 mg，用適量30%甲醇溶解后，定容于10 mL量瓶中。精密吸取上述對照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.75 mL，分別置5 mL量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，測定。以哈巴俄苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程，回歸方程為Y=47.711X+35.172，r=0.999 6，結果表明，哈巴俄苷在8.16～30.6 μg/mL呈良好的線性關系。

測定法:精密吸取各樣品濃縮液5 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60℃減壓真空干燥，放冷，干膏用30%甲醇適量溶解后，定容于50 mL量瓶中。搖勻，0.22 μm濾膜濾過，即得。各供試品溶液分別進樣20 μL，依次測定峰面積，從標準曲線上讀出各供試品溶液中哈巴俄苷濃度，計算哈巴俄苷煎出率。

2.7 菝葜皂苷元煎出率的測定［3，4］色譜條件:色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇－水(98:2);流速:1 mL/min;柱溫:25℃;漂移管溫度:62℃;氣體流速:1.6 mL/min;不分流模式;在此色譜條件下理論塔板數(shù)按菝葜皂苷元峰計算不低于4 000。

標準曲線的繪制:準確稱取干燥至恒重的菝葜皂苷元對照品7.58 mg，用適量甲醇溶解后，定容于25 mL量瓶中，搖勻。分別精密吸取上述對照品溶液各 1、2、4、6、8、9、10 μL，注入液相色譜儀，測定。以菝葜皂苷元進樣量的對數(shù)值為橫坐標，以峰面積的對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程，回歸方程為Y=1.594 4X+3.555 8，r=0.999 94，結果表明，菝葜皂苷元在0.303 2～3.032 μg線性關系良好。

2.8 水提正交試驗結果 各個因素水平對哈巴俄苷煎出率的影響并無顯著性差異，但因素A和B對菝葜皂苷元的煎出率有顯著作用?？紤]到A2和A3相差不大、以及工廠常規(guī)操作的需要，浸泡時間確定為2 h;因素B應選B3即分別加12、10倍量水，鑒于C對各個指標并無明顯影響作用，考慮到節(jié)約成本、減少浪費的需要，將提取時間定為1、1 h。由此確定最佳提取條件為:浸泡2 h，一煎加12倍量水、煎煮1 h，二煎加10倍量水，煎煮1 h，提取2次(見表4～6)。

表4 浸膏煎出率結果的方差分析

表5 哈巴俄苷煎出率結果的方差分析

表6 菝葜皂苷元煎出率結果的方差分析

2.9 驗證試驗 稱取全方藥材兩份(每份90 g，成人一天入湯劑的量)，按照正交試驗結果所確定的最佳提取工藝即浸泡2 h，一煎加12倍量水、二煎加10倍量水，煎煮提取兩次，每次1 h，合并濾液，濃縮定容至100 mL量瓶中。取樣，測定哈巴俄苷和菝葜皂苷元的煎出率，收膏率。結果見表7。

表7 驗證試驗結果

結果表明:用最佳工藝條件提取，干膏得率、哈巴俄苷和菝葜皂苷元的轉移率均較穩(wěn)定。

3 討論

加減玉女煎主治溫熱病、高熱煩渴，方中生石膏為君藥、石膏性寒，主要為含水硫酸鈣(CaSO4·2H2O)，此外還含有多種無機元素，如銅、鐵、鋁等［5］。有報道石膏的解熱作用與硫酸鈣無關，可能與所含的微量元素有關［6］。知母和玄參為臣藥，已有文獻報道，知母中菝葜皂苷元和玄參中哈巴俄苷對陰虛征候都具有一定的改善作用［7－9］，故選擇這兩個成分作為指標成分研究加減玉女煎的最佳提取工藝。

哈巴俄苷、知母皂苷均溶于水，因此可以利用水為溶媒將其提取出來，但兩者化學結構又有所不同，前者屬環(huán)烯醚萜苷，后者屬甾體皂苷。環(huán)烯醚帖類成分的共性是不太穩(wěn)定，隨著加熱時間的延長往往會受到破壞，對于此類成分的提取，要在保證達到最大提取率的情況下，盡量縮短提取時間。

皂苷類是知母中的主要有效成分，是衡量知母藥材質(zhì)量的最主要指標。知母皂苷類主要包括知母皂苷A類、B類、C類和D類等。這類成分在紫外無吸收，到目前為止，大多學者對于單味知母藥材中皂苷類的HPLC含量測定研究較少，對于制劑中知母皂苷類的HPLC含量測定研究尚未見報道。菝葜皂苷元為脂溶性成分，它在知母中并不是主要的存在形式，而是知母藥材經(jīng)提取知母總皂苷，總皂苷水解后進一步純化得到。知母所含甾體皂苷種類較多，水解后的皂苷元大多是菝葜皂苷元，因此它可以間接反映所含皂苷的總量，并且它具有一定的藥理作用，結構清楚、性質(zhì)穩(wěn)定，所以2005版藥典把它作為知母含量測定指標成分。但是，畢竟知母皂苷類的原本存在狀態(tài)是以皂苷的形式，而不是皂苷元，在藥材飲片煎煮或制成成藥后起治療作用的成分也是皂苷。又加之菝葜皂苷元樣品處理過程繁瑣、中間轉移步驟多、易造成較大的誤差，所以選擇知母藥材中含量較多的某一種皂苷成分進行定量研究和藥材質(zhì)量控制，應該更加合理，也值得進一步研究。

加減玉女煎除石膏外，其余四味都含有大量的糖和苷類。這兩類成分具有良好的親水性，容易被水提取出來。正交和驗證試驗都表明，水提加減玉女煎干膏的提取率基本都在40%左右，直接將其制成固體制劑尚有難度。因此，下一步的研究重點是在保證浸膏有效的前提下，選擇合適的除雜工藝對浸膏進行精制。

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