HPLC法同時測定補腎壯骨顆粒中淫羊藿苷及柚皮苷含量

韓麗萍， 陳行愉， 鄧偉民

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東廣州 510010)

補腎壯骨顆粒由淫羊藿、骨碎補、鹿角膠等七味藥材制成，具有補腎壯骨、健脾和胃、祛瘀止痛的作用，可用于各種原發(fā)性骨質疏松。其中淫羊藿和骨碎補為主藥，淫羊藿中淫羊藿苷等黃酮類化合物為其主要活性成分，骨碎補其主要活性成分為柚皮苷等二氫黃酮類化合物。筆者曾對補腎壯骨顆粒中的淫羊藿苷進行測定［1］，但對于一個復方制劑而言，僅對其中一種成分進行測定，還略顯不足，為了更進一步地評價補腎壯骨顆粒的質量，本實驗參考相關文獻［2］，采用HPLC法同時測定淫羊藿苷及柚皮苷含量。結果證明，該法操作簡便，重現(xiàn)性好，且準確穩(wěn)定，可為全面評價補腎壯骨顆粒的質量提供依據。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀:配有二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站(美國惠普公司)，Sartorius BP211D分析天平(德國賽多利斯公司)，KP-Q-1200超聲波清洗機(廣州科普超聲電子技術有限公司)。

補腎壯骨顆粒(廣州軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心提供，批號分別為 081114，090402，090605，090921)，淫羊藿苷、柚皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110737-200415、110722-200610)，95%乙醇、甲醇(分析純)、乙腈(色譜純，為SIGAM產品)。流動相用水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應性試驗 色譜柱:Inertsil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:A 相為水，B 相為乙腈，B相濃度梯度:0～8 min，體積分數(shù)為25%，8～9 min，體積分數(shù)為25% ～30%，9～22 min，體積分數(shù)為30%，檢測波長285 nm;流速1 mL/min;柱溫30℃;進樣量10 μL。各峰的理論塔板數(shù)不低于3 000，與相鄰的峰的分離度均大于1.5。在上述色譜條件下，對照品、樣品和陰性樣品的色譜圖見圖1。

2.2 線性關系考察 分別取淫羊藿苷及柚皮苷對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成1 mL約含淫羊藿苷0.6 mg，柚皮苷0.4 mg的混合對照品貯備溶液。精密吸取對照品貯備溶液適量，加甲醇分別稀釋成每毫升含柚皮苷約為 0.4、0.08、0.04、0.016、0.008、0.004 mg，含淫羊藿苷約為 0.6、0.12、0.06、0.024、0.012、0.006 mg的對照品系列溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，得各組分的線性范圍和回歸方程，淫羊藿苷在進樣量0.060 6～6.6 μg范圍內線性關系良好，Y=1 053.6X+9.400 7，r=0.999 9;柚皮苷在進樣量0.087 4～8.74 μg范圍內線性關系良好，回歸方程:Y=1 538.8X+27.511，r=0.999 9。

淫羊藿苷和柚皮苷的最低檢出限分別為20.2 ng和29.1 ng，定量限分別為52.5 ng和75.7 ng。

2.3 供試品溶液制備方法考察 精密稱取補腎壯骨顆粒約2 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，精密稱定，考察下列提取方法:①浸泡2 h，超聲提取30 min;②回流提取30 min;③浸泡2 h，超聲提取30 min，繼續(xù)回流提取30 min。上述3種提取液放冷至室溫，以甲醇補足損失，濾過。精密吸取續(xù)濾液25 mL至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

圖1 補腎壯骨顆粒HPLC色譜圖

取上述3種供試品溶液，按照2.1項下方法，測定淫羊藿苷和柚皮苷含量，結果表明，回流提取與超聲提取對淫羊藿苷影響較小，而柚皮苷用回流提取優(yōu)于超聲提取，但單純超聲或回流提取，兩種成分均不能提取完全，因此確定采用超聲加回流的方法進行提取，見表1。

表1 不同制備方法對含量的影響(n=3)

2.4 精密度試驗 按照2.3項下第三法制備供試品溶液，按照2.1項色譜條件下進樣10 μL，重復6次，以淫羊藿苷和柚皮苷峰面積計算RSD，其結果分別為0.56%、0.58%，說明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 取同一批補腎壯骨顆粒樣品(批號:090921)，按照2.4項下第三法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項色譜條件下進樣10 μL，計算淫羊藿苷和柚皮苷含量的RSD分別為1.17%、1.39%，說明該法重復性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品，按照2.1項色譜條件分別在0、1、2、4、6、8、24 h 進樣10 μL，測定峰面積，計算淫羊藿苷和柚皮苷峰面積的RSD分別為0.88%、1.15%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好，可滿足測定要求。

2.7 加樣回收率試驗 取已知淫羊藿苷、柚皮苷含量的補腎壯骨顆粒(批號:090921)6份各約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入淫羊藿苷、柚皮苷對照品甲醇溶液適量，按2.4項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定含量，求得淫羊藿苷和柚皮苷的回收率，結果見表2。

2.8 樣品含量測定 取大生產的4批樣品，按2.4項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別將混合對照品和供試品溶液進樣10 μL，記錄淫羊藿苷和柚皮苷的色譜峰面積，外標法計算含量，結果見表3。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

表3樣品測定結果(n=3)

3 討論

由于柚皮苷和淫羊藿苷性質差異較大，為了能使兩組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的，以不同比例的乙腈-水為流動相對色譜條件進行考察。結果表明，當流動相為乙腈-水的起始濃度為25:75時，各組份能達到較好的分離。采用乙腈-水單一比例測定淫羊藿苷約10 min［1］，但柚皮苷不能很好分離。骨碎補藥材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量同時測定用時為20 min［3］，本方法2組分同時測定用時約20 min，縮短了多組份檢測的分析時間。進一步的對比研究發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫可以消除雜質對被測成分的干擾，避免因使用聚酰胺進行凈化處理［1］導致被測成分的損失，大大節(jié)省了樣品制備的時間及溶劑，適于全面評價補腎壯骨顆粒的質量。

淫羊藿苷的最大吸收波長為270 nm，柚皮苷的最大吸收波長為285 nm，本實驗考察了在波長為270及285 nm條件下的吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)在285 nm單一波長下，淫羊藿苷及柚皮苷同時可以得到較好的色譜峰。也可用雙通道檢測，在270 nm波長下檢測淫羊藿苷，在285 nm下波長檢測柚皮苷。

本次實驗對不同批次補腎壯骨顆粒含量進行測定，結果顯示，不同批次樣品之間淫羊藿苷含量差異較大，與筆者之前的報道［1］不相符，主要原因是報道中的3批樣品均使用同一批次藥材制備，而本次實驗的樣品使用不同批次藥材制備，但市面上淫羊藿藥材的質量參差不齊，筆者測定不同批次的淫羊藿藥材，淫羊藿苷含量差異可達到10倍以上，因此控制原藥材質量，是保證中藥制劑質量的根本措施。

［1］韓麗萍，梁 達，劉志剛，等.補腎壯骨顆粒質量標準的研究［J］. 解放軍藥學學報，2009，25(2):145-147.

［2］李 超，葛 潔，鹿秀梅，等.RP-HPLC法測定骨疏丹顆粒中5種有效成分的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2008(9):728-731.

［3］李遇伯，孟繁浩，李發(fā)美，等.HPLC同時測定骨碎補藥材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2006，23(6):808-810.