懸浮固化液相微萃取高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中磺胺類藥物

沈楊銀，饒桂維，蔡婕妤，卜興明，傅煜豪

（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015）

磺胺類抗生素（Sulfonamides，SAs）屬于人工合成的抗菌藥物，基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為對氨基苯磺酰胺。由于具有抗菌譜廣、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價格便宜、使用方便等優(yōu)點，SAs 被廣泛使用于牲畜養(yǎng)殖業(yè)中［1］。根據(jù)統(tǒng)計，SAs 在世界各國的抗生素銷售及使用量中均居于首位［2］。大量施用的SAs 會通過農(nóng)田土壤地表徑流沖刷滲濾、畜禽糞便排放、污水處理廠出水等途徑最終進入水體環(huán)境［3］。SAs 在動物體內(nèi)的代謝時間較長，容易殘留在動物產(chǎn)品當中，水體環(huán)境中的SAs 會通過食物鏈進入人體，在人體內(nèi)蓄積，造成泌尿、免疫和造血系統(tǒng)紊亂，誘發(fā)皮炎等過敏反應(yīng)并具有致癌性，還會導(dǎo)致人體出現(xiàn)急性或慢性中毒，從而威脅人體健康，因此研究磺胺類藥物的檢測方法很有重要。

目前，檢測磺胺類藥物殘留的方法主要有氣相色譜–質(zhì)譜（GC–MS）法［4］、高效液相色譜（HPLC）法［5］、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜（LC–MS）法［6］、毛細管電泳法［7］、酶聯(lián)免疫分析法［8］等。樣品前處理是分析過程的重要組成部分。傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)有固相萃取（SPE）［9］、固相微萃?。⊿PME）［10］、液液萃?。↙LE）［11］、液相微萃?。↙PME）［12］。這些前處理技術(shù)普遍存在以下缺點：處理時間長，試劑用量大，萃取速度慢，儀器價格高，操作繁瑣，高毒性，實現(xiàn)自動化困難，難以滿足對痕量污染物監(jiān)測的要求［13］。LPME 技術(shù)逐漸發(fā)展，分為單液滴微萃?。⊿DME）［14］、中空纖維液相微萃?。℉FLM）［15］、分散液–液微萃?。―LLME）［16］、懸浮固化液相微萃?。⊿FO–LPME）。

單液滴微萃取技術(shù)是將有機萃取劑懸掛于針頭上進行萃取的技術(shù)，人工難以控制，難以達到要求的精確度與準確度，此技術(shù)的萃取效率由液滴的量來決定，但較大液滴在針頭上非常容易掉落，影響萃取效率。中空纖維液相微萃取技術(shù)中纖維孔隙很小，孔徑一般為0.2 μm，容易存在樣品堵塞微孔的現(xiàn)象，該技術(shù)操作較為繁瑣，萃取速率慢，難以實現(xiàn)自動化。分散液–液微萃取技術(shù)樣品溶液若含有顆粒和大分子會影響萃取效果，該技術(shù)常選用鹵代烴作為有機萃取劑，而鹵代烴毒性較強，容易對實驗人員造成傷害，且對環(huán)境有嚴重污染。

懸浮固化液相微萃取技術(shù)由Yamani 等［17］于2007 年提出，具有萃取時間短、成本低、操作簡便、有機溶劑用量少、對環(huán)境友好等優(yōu)點，是一種新型的樣品前處理技術(shù)，在與HPLC 儀、原子吸收光譜（AAS）儀、GC 儀、高效毛細電泳（HPCE）儀等聯(lián)用后，可以對目標物進行定性和定量分析，在痕量分析領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。懸浮固化液相微萃取通常使用磁子攪拌進行萃取，萃取過程要求實驗人員具有一定的專業(yè)技能且耗時較長。筆者采取懸浮固化液相微萃取技術(shù)與液相色譜聯(lián)用，采用渦旋輔助微萃取，建立了以懸浮固化液相微萃取技術(shù)測定環(huán)境水樣中磺胺類藥物的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：P230II 型，配UV230II 型紫外可見檢測器、LU230II 型低壓梯度混合器、P230II 型高壓恒流泵，大連伊利特分析儀器有限公司；

超純水器：UPWS–1–60D 型，杭州永潔達凈化科技有限公司；

渦旋混合器：SW–80A 型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

臺式高速冷凍離心機：GL–20G–H 型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電子天平：MS205DU 型，瑞士梅特勒–托利多集團；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ5200DE 型，昆山市超聲儀器有限公司；

隔膜真空泵：GM–0.33 型，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；

磺胺嘧啶（SD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺對甲氧嘧啶（SMD）標準樣品：純度均不小于98%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國天地試劑公司；

正十二醇：純度不小于99%，上海麥克林生化科技有限公司；

磷酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取60 mg SD 標準樣品，100 mg SM2 標準樣品，140 mg SMD 標準樣品，用乙腈溶解并定容至100 mL 容量瓶中，配制成SD 質(zhì)量濃度為600 mg／L，SM2 質(zhì)量濃度為1 000 mg／L，SMD質(zhì)量濃度為1 400 mg／L 的標準儲備溶液，置于4℃冰箱中備用。使用前用乙腈稀釋成SD 質(zhì)量濃度為3.75～60 mg／L，SM2 質(zhì)量濃度為6.25～100 mg／L，SMD 質(zhì)量濃度為8.75～140 mg／L 的系列混合標準工作溶液。

1.3 模擬水樣的配制

用燒杯稱取適量SAs（SD，SM2，SMD），以乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中，用去離子水定容，搖勻后配制成一定濃度的模擬水樣。

1.4 樣品采集與前處理

將采集的水樣儲存于50 mL 離心管中，在實驗室冰箱中冷藏保存過夜，次日，取搖晃均勻后的10 mL 水樣，加入0.8 mL 正十二醇，渦旋1 min，在4 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，將離心后的溶液冰水浴5 min，用藥匙將固化后的正十二醇取出，置于干凈的離心管中，待正十二醇融化后加入0.8 mL 甲醇，將樣品溶液過0.22 μm 濾膜，進樣至高效液相色譜儀中進行分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS–BP 型柱（4.6 mm× 200 mm，5 μm，大連伊利特分析儀器有限公司）；柱溫：30℃；流動相：體積分數(shù)為0.1%的磷酸水溶液–乙腈（90∶10），流量為1 mL／min；進樣體積：10 μL；檢測波長：270 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑的選擇

懸浮固化液相微萃取要求萃取劑具有水溶性低、不易揮發(fā)、密度小于水、熔點接近或低于室溫（10～30℃）、萃取容量高和對分析物測定沒有干擾等特點。實驗室經(jīng)常使用正十一醇、正十二醇、正十六烷、溴代十六烷作為萃取劑。選擇正十一醇和正十二醇進行試驗，發(fā)現(xiàn)相同條件下正十一醇在萃取SAs 時冰浴后沒有固化現(xiàn)象，有機相不能與水相分離，不能滿足萃取要求，而用正十二醇萃取SAs時效果良好，故選擇正十二醇作為萃取劑。

2.2 輔助乳化條件的選擇

懸浮固化液相微萃取技術(shù)會利用渦旋和超聲等形式輔助乳化，渦旋可以加快萃取劑與模擬水樣之間的傳質(zhì)速率，加速乳化形成，縮短萃取時間。懸浮固化液相微萃取技術(shù)利用超聲輔助時，萃取劑在超聲輔助下以微小液滴的形式分散于水相中，與水相之間形成巨大的接觸面，從而加快物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)萃取目的。對超聲輔助和渦旋輔助進行對比試驗，結(jié)果如圖1。由圖1 可知，在相同條件下，渦旋比超聲具有更高的提取率；并且在萃取過程中，渦旋比超聲耗時更短，耗能更少；而且渦旋設(shè)備便于攜帶。故選擇渦旋輔助乳化進行微萃取操作。

圖1 不同乳化輔助方式下SAs 的提取率

2.3 萃取劑用量的優(yōu)化

萃取劑用量是影響水樣中SAs 提取率的重要因素之一，因為正十二醇與水相的接觸面積與SAs向正十二醇的傳質(zhì)效率有很大關(guān)系，隨著萃取劑用量的增加，SAs 的提取率也會隨之提高。試驗對比了0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0，1.1 mL 正 十 二 醇 萃 取10 mL 水樣的提取率（如圖2 所示）。試驗結(jié)果表明，萃取10 mL 環(huán)境水樣中的SAs，使用0.8 mL 正十二醇時提取率最高。由圖2 可知，隨著正十二醇用量的增大，SAs 的提取率逐漸升高，而正十二醇的最佳萃取劑用量為0.8 mL。當萃取劑用量超過0.8 mL時，隨著正十二醇用量的增大，SAs 的提取率下降，這是過多的萃取劑起到稀釋作用導(dǎo)致，故選擇萃取劑最佳用量為0.8 mL。

圖2 不同萃取劑用量時的SAs 提取率

2.4 溶液pH 值對提取率的影響

溶液pH 對SAs 的提取率也有影響。調(diào)節(jié)水樣pH，改變SAs 的狀態(tài)，使其處于分子或離子狀態(tài)，從而影響SAs 的提取率。分別使用硫酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH，用pH 計測得模擬水樣pH 為5.3。SD 易溶于稀鹽酸、氫氧化鈉溶液(SM2易溶于稀酸和稀堿溶液，SMD 易溶于稀酸)。pH為3.3～7.3時SAs的提取率如圖3所示。由圖3可知，溶液pH 為7.3 時，SM2 的提取率明顯高于其它兩種藥物，溶液pH 為3.3 時，SMD 的提取率明顯高于另外兩種藥物。這是因為SM2 易溶于稀堿，SMD易溶于稀酸，酸堿性試劑的加入有利于SM2，SMD在模擬水樣中的溶解，從而提高提取率。試驗結(jié)果表明，不調(diào)節(jié)模擬水樣pH 時3 種SAs 的綜合提取率最好，故選取pH 5.3 進行后續(xù)試驗。

圖3 不同pH 時的SAs 提取率

2.5 渦旋時間對提取率的影響

萃取時間是影響提取率的一項要素，使用渦旋的方法進行萃取試驗，在渦旋過程中，足夠的萃取時間可以使目標分析物最大程度地轉(zhuǎn)移進入萃取劑中，提高SAs 的提取率。圖4 展示了不同渦旋時間對應(yīng)的SAs 提取率，由圖4 可見，渦旋時間為15～60 s 時，SAs 提取率隨著渦旋時間的增長而增大，在渦旋時間為60 s 時SAs 提取率達到最大，然后呈下降趨勢。原因是渦旋時間太短會導(dǎo)致萃取劑與水樣中的SAs 不能達到分配平衡，SAs 未能最大程度地進入正十二醇；渦旋時間過長則會造成乳濁液不穩(wěn)定，SAs 提取率也會降低且浪費能量。綜合考慮，選取最佳渦旋時間為60 s。

圖4 不同渦旋時間時的SAs 提取率

2.6 離心時間對提取率的影響

分別選擇離心時間為1，3，5，7，9 min，考察SAs的萃取率，試驗結(jié)果如圖5 所示。試驗發(fā)現(xiàn)隨著離心時間增加，SAs 的提取率起初隨之提高，在離心時間為5 min 時達到最大，然后呈下降趨勢。最初提取率隨著離心時間增加而提高，可能是因為過短的離心時間導(dǎo)致萃取劑萃取完SAs 后與水樣分層不夠完全，冰浴后固化的十二醇結(jié)構(gòu)松散，收集較為困難，會有所損耗，導(dǎo)致SAs 提取率較低。而隨著離心時間的增加，SAs 提取率達到峰值后即形成動態(tài)平衡，而過長的離心時間會導(dǎo)致耗能增加。綜合考慮，選取離心時間為5 min。

圖5 不同離心時間時的SAs 提取率

2.7 離心轉(zhuǎn)速對提取率的影響

在2 000～6 000 r／min 區(qū)間分別設(shè)置不同的離心轉(zhuǎn)速，考察離心轉(zhuǎn)速對SAs 提取率的影響，試驗結(jié)果如圖6 所示。試驗結(jié)果表明，SAs 的提取率隨著離心轉(zhuǎn)速的上升而增大，在離心轉(zhuǎn)速為4 000 r／min 時SAs 的萃取率達到極值，然后開始降低。這可能是由于離心轉(zhuǎn)速過高導(dǎo)致SAs 分解，破壞了正十二醇的結(jié)構(gòu)，從而使SAs 的提取率降低。為了使萃取SAs 的正十二醇與樣品溶液充分分離，選則最佳離心轉(zhuǎn)速為4 000 r／min。

圖6 不同離心轉(zhuǎn)速時的SAs 提取率

2.8 線性范圍、檢出限與定量限

配制質(zhì)量濃度分別為3.75，7.5，15，30，60 mg／L 的系列SD 標準工作溶液，質(zhì)量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100 mg／L 的系列SM2 標準工作溶液，質(zhì)量濃度分別為8.75，17.5，35，70，140 mg／L 的系列SMD 標準工作溶液，在1.5 色譜條件下測定，以SAs的質(zhì)量濃度（x，mg／L）為自變量、色譜峰面積（y）為因變量進行線性回歸，計算線性方程、相關(guān)系數(shù)。

以信噪比（S／N）為3 時對應(yīng)的標準溶液質(zhì)量濃度為方法檢出限，信噪比為10 對應(yīng)的標準溶液質(zhì)量濃度為定量限。

線性范圍、線性方程、檢出限和定量限列于表1。由表1 可知，SD，SM2，SMD 的質(zhì)量濃度分別在3.75～60，6.25～100，8.75～140 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.999 2，SD，SM2，SMD 的檢出限分別為0.48，0.72，0.92 mg／L，定量限分別為1.59，2.40，3.05 mg／L。

表1 3 種SAs 標準曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.9 加標回收試驗

分別取質(zhì)量濃度為15，30，60 mg／L 的SD 溶液，質(zhì)量濃度為25，50，100 mg／L 的SM2 溶液和質(zhì)量濃度為35，70，140 mg／L 的SMD 溶液，按1.4 方法處理，在1.5 色譜條件下進行加標回收試驗，平行試驗5次，計算平均回收率和相對標準偏差，試驗結(jié)果列于表2。加標樣品色譜圖如圖7。由表2 可知，該方法SD，SM2，SMD 的精密度良好，SM2，SMD 回收率良好。SD 鑒于其本身幾乎不溶于水的物理性質(zhì)，使用該方法情況下?lián)p耗較大，導(dǎo)致其回收率較差。

表2 加標回收試驗結(jié)果

圖7 加標樣品色譜圖

2.10 穩(wěn)定性試驗

吸取同一標準混合溶液10 μL，分別在0，2，4，6，8，10 h 于1.5 色譜條件下進樣測定，記錄色譜峰面積，計算峰面積測定值的相對標準偏差，SD，SM2，SMD 的色譜峰面積測定值的相對標準偏差分別為2.8%，1.8%，2.3%，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)語

建立了一種懸浮固化液相微萃取–高效液相色譜聯(lián)用測定環(huán)境水樣中磺胺類藥物的方法，實驗過程中以正十二醇作為萃取劑采取渦旋輔助微萃取，該方法試劑用量少，操作簡便，成本低廉，對環(huán)境友好，準確性、重現(xiàn)性好，可以滿足樣品分析的要求，為測定磺胺類藥物在環(huán)境水樣中的含量提供新思路和新的技術(shù)支持。