高效液相色譜法測定阿比特龍的純度

韋林洪，徐志英，丁娟芳，劉蘇閩，張軍

（1.揚州市職業(yè)大學生物與化工工程學院，江蘇揚州 225009； 2.揚州市職業(yè)大學園林園藝學院，江蘇揚州 225009；3.揚州市職業(yè)大學科技產(chǎn)業(yè)處，江蘇揚州 225009）

2011 年美國FDA 批準阿比特龍乙酸酯（商品名為Zytiga）與潑尼松、強的松、多西他賽等藥物聯(lián)用治療去勢抵抗性前列腺癌［1–8］，阿比特龍（Abiraterone）是生產(chǎn)阿比特龍乙酸酯的主要原料，其化學名稱為17-（3-吡啶基）雄甾-5，16-二烯-3β-醇，它通過抑制細胞色素氧化酶（P450C17）的活性阻斷雄性激素的生成。藥物的含量是評價其質(zhì)量的重要指標，也是制劑生產(chǎn)時計算投料量的依據(jù)，因此，測定阿比特龍的含量對于監(jiān)控原料的質(zhì)量及制劑的生產(chǎn)非常重要。

美國藥典（USP 40）收載了阿比特龍乙酸酯及其片劑的檢測方法［9］，但未收載阿比特龍的檢測方法，也未見其它藥典收載阿比特龍的檢測方法。有采用高效液相色譜法［10–11］、質(zhì)譜法［12］和液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法［13–15］測定血漿樣品中阿比特龍及其代謝物含量的報道，但未見文獻報道阿比特龍含量測定的方法。龔愛琴等［4］采用高效液相色譜法測定阿比特龍乙酸酯的含量并對分析方法進行驗證，該法能同時分離阿比特龍和阿比特龍乙酸酯，但文獻并未用此法測定阿比特龍的含量。筆者建立了高效液相色譜法測定阿比特龍原料藥中阿比特龍的含量并進行了方法學驗證。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，配G1312B型二元泵、G1314F 型變波長檢測器、G1329B 型自動進樣器、G1316A 型柱溫箱和Agilent Chemstation工作站，美國安捷倫科技有限公司；

分析天平：AR2140 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒·托利多公司；

高功率數(shù)控超聲波清洗器：KQ–400KDE 型，昆山超聲儀器有限公司；

阿比特龍標準樣品：純度為99.7%，批號為A0534，上海惠誠生物科技有限公司；

阿比特龍樣品：藥物原料，批號分別為20160811，20160814，20160820，揚州聯(lián)澳生物醫(yī)藥有限公司；乙腈：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水：屈臣氏蒸餾水。

1.2 溶液配制

阿比特龍標準樣品儲備液：0.8 mg／mL，精確稱取阿比特龍標準樣品40 mg，用乙腈–水（7∶3）稀釋至50 mL，搖勻。

阿比特龍標準樣品溶液：0.4 mg／mL，取阿比特龍標準樣品儲備液5 mL，用乙腈–水（7∶3）稀釋至10 mL，搖勻。

阿比特龍樣品溶液：0.4 mg／mL，精密稱取阿比特龍樣品20 mg，用乙腈–水（7∶3）稀釋至50 mL，搖勻。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；流動相：乙腈–水（1∶1）溶液，流量為1.2 mL／min；進樣體積：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

改變色譜條件對阿比特龍樣品溶液進行分析，以考察色譜條件變化對測定結(jié)果的影響。色譜條件變化如下：（1）分別選用美國安捷倫科技有限公司的Agilent C18型色譜柱(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm) 和Agilent ZorbaxSB C18型 色 譜 柱(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm)；（2）柱溫分別設(shè)置為25，30，35℃；（3）流動相流量分別設(shè)定為1.0，1.2，1.4 mL／min；（4）流動相中乙腈的體積分數(shù)分別設(shè)定為45%，50%，55%。試驗結(jié)果表明，在以上范圍內(nèi)改變色譜條件，理論塔板數(shù)和拖尾因子均能滿足分析要求，不同條件下測得樣品含量為98.68%～99.54%。Agilent C18色譜柱柱效略優(yōu)于Agilent ZorbaxSB C18色譜柱；為了節(jié)省能源、便于操作，色譜柱溫選擇25℃；為了提高分析方法的穩(wěn)定性和耐用性，流動相流量及流動相中乙腈的體積分數(shù)均采用中位值。

2.2 系統(tǒng)適應性試驗

取2 份阿比特龍標準樣品溶液，在1.3 色譜條件下，分別進樣乙腈–水（7∶3）1 次、第1 份阿比特龍標準樣品溶液進樣5 次、第2 份阿比特龍標準樣品溶液進樣1 次。試驗結(jié)果表明：阿比特龍的保留時間為8.322 min，稀釋劑乙腈–水（7∶3）中沒有與阿比特龍色譜峰保留時間相同的成分，第1 份阿比特龍標準樣品5 次進樣色譜峰面積的相對標準偏差為0.38%，2 份阿比特龍標準樣品溶液的主色譜峰保留時間相同，理論塔板數(shù)以阿比特龍計大于5 000，拖尾因子0.80。系統(tǒng)適應性試驗符合要求。

2.3 專屬性試驗

精密稱取阿比特龍樣品20 mg 于6 只50 mL容量瓶中，分別進行以下破壞性處理：

（1）酸破壞：將阿比特龍樣品用5 mL 乙腈–水（7∶3）溶解，加入0.5 mol／L 鹽酸溶液2 mL，于室溫下放置2 h，用0.5 mol／L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性。

（2）堿破壞：將阿比特龍樣品用5 mL 乙腈–水（7∶3）溶解，加入0.5 mol／L 氫氧化鈉溶液2 mL，于室溫下放置2 h，用0.5 mol／L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性。

（3）氧化破壞：將供試品用5 mL乙腈–水（7∶3）溶解，加入30%的過氧化氫溶液2 mL，于室溫下放置2 h。

（4）高溫破壞：將供試品用5 mL乙腈–水（7∶3）溶解，于90℃水浴加熱2 h，放冷至室溫。

（5）光照破壞：將供試品于紫外光下照射5 h。

（6）高濕破壞：將供試品置于相對濕度為（90±5）%的干燥器中放置5 d。

經(jīng)過破壞性處理的樣品分別用流動相稀釋至容量瓶標線，搖勻，過濾，在1.3 色譜條件下依次進樣測定。圖1 為阿比特龍樣品色譜圖。由圖1 可知，阿比特龍色譜峰與樣品中其它雜質(zhì)色譜峰分離良好，雜質(zhì)色譜峰不影響阿比特龍的含量測定，該法專屬性較強。試驗結(jié)果表明：阿比特龍在酸、堿、氧化、高溫、光照、高濕條件下相對穩(wěn)定，與主色譜峰相比，其降解雜質(zhì)可以忽略。

圖1 阿比特龍樣品色譜圖

2.4 線性范圍

將阿比特龍標準樣品儲備液用乙腈–水（7∶3）稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為40～520 μg／mL 的系列標準工作溶液，在1.3色譜條件下，依次進樣測定，每份溶液重復測定3 次，記錄并計算色譜峰面積平均值。以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標、色譜峰面積平均值為縱坐標，繪制標準曲線，計算得線性方程為A=31.957 2c+136.165 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，表明阿比特龍的質(zhì)量濃度在40～520 μg／mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 檢出限與定量限

用乙腈–水（7∶3）將40 μg／mL 的阿比特龍標準溶液逐級稀釋后進樣分析，分別以信噪比（S／N）3 和10 計算，阿比特龍的檢出限和定量限分別為0.24，1.2 μg／mL。

2.6 精密度試驗

分別稱量6 份阿比特龍樣品，按照1.2 方法配制成樣品溶液，按1.3 色譜條件進樣測定，測定結(jié)果列于表1。由表1 可知，測定值的相對標準偏差為0.27%，表明本方法精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.7 標準樣品測定

精密量取阿比特龍標準樣品儲備液4.0，5.0，6.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用乙腈–水（7∶3）稀釋至標線，制成320，400，480 μg／mL 的溶液(對應于樣品溶液濃度的80%，100%，120%），每種溶液平行制備3 份，按1.3 色譜條件進行分析，計算回收率，結(jié)果列于表2。由表2 可知：阿比特龍回收率為99.12%～99.88%，符合《中國藥典》 （2015 版）的規(guī)定。

表2 標準樣品測定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

取阿比特龍標準樣品溶液，在室溫下分別放置0，2，4，6，12，24，48 h，按1.3 色譜條件進樣分析，測得阿比特龍的含量為(99.16±0.29)%，測定值的相對標準偏差為0.2%，結(jié)果表明樣品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法測定阿比特龍原料中阿比特龍的含量，該方法專屬性強，具有較高的精密度和準確度。與質(zhì)譜法、液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法相比，本法儀器價格低廉,操作簡便,易于推廣，可為阿比特龍原料藥含量測定標準制訂提供技術(shù)參考。