金剛藤對肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標的影響▲

李 凱 秦 堅 黃李平 呂軍影

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，電子郵箱：likaizhongxiyi@yeah.net；2 廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，南寧市 530021)

金剛藤屬于壯藥，主產于廣西、湖南等地區(qū)，具有祛風利濕、活血化瘀、解毒散結等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，金剛藤提取物具有抑制炎癥、減輕水腫、改善血液循環(huán)、調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化等藥理作用[1]。金剛藤作為一種民間常用藥，多用于治療婦科炎癥、風濕關節(jié)痛、 跌打損傷等病，其臨床效果較為肯定[2]。臨床上常將其作為活血化瘀藥和補虛藥，或者清熱藥、理氣藥，用于肝病的治療[3]。但金剛藤對肝纖維化的干預效果如何，鮮見研究報告。本研究探討金剛藤對肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只周齡6～8周的SD大鼠，雌雄各半，平均體重200 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK桂2014-002。

1.2 主要藥品及試劑 四氯化碳分析純購自天津市化學試劑公司，將四氯化碳與花生油(魯花牌)按4 ∶6的比例調制成濃度為40% 四氯化碳花生油混合液備用。金剛藤干燥厚片購于廣西醫(yī)藥公司(批號：14392014003)?？偰懠t素、白蛋白、ALT、AST試劑盒由北京生物技術研究所提供(批號：JLC1728、JLC1586、JLC1033、JLC1905)。透明質酸、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原和Ⅲ型前膠原(procollagen type Ⅲ，PCⅢ)試劑盒由北京生物技術研究所提供(批號：CK-E30401R、CK-E30645R、CK-E91483R、CK-E30178R)。

1.3 分組及動物模型的制作 將50只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按隨機數字表法將其分為正常對照組、模型對照組、金剛藤低劑量組、中劑量組、高劑量組。除正常對照組外，其余4組大鼠參照文獻[4]制作動物模型：第1周按5 mL/kg腹腔注射40% 四氯化碳混合液1次；第2周開始按3 mL/kg腹腔注射40% 四氯化碳混合液，每周2次，共6周；第8周開始，按3 mL/kg腹腔注射40%四氯化碳混合液，每周1次，共4周。5組大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)和飲用自來水。

1.4 金剛藤水煎劑的制備 金剛藤水煎劑由廣西醫(yī)科大學藥理實驗室制備：將200 g金剛藤浸泡20～30 min，水浸過藥面約2 cm，武火(1 800 W)煮沸后改用文火(600 W)煎30 min，冷卻30 min后濾渣取汁；藥渣按上述步驟再煎煮2次，分別取汁，將每次獲得的藥液混合，用文火煮濃縮至100 mL左右，配制成2 g/mL金剛藤水煎劑，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 給藥方法 根據成人每日金剛藤用量為20 g，按照人鼠體表面積換算法給藥，計算方法如下：(20÷60)×6.25×0.25=0.5g。將該常規(guī)藥量設為中劑量，低劑量為0.25g,高劑量為1 g，即分別為2 g/(kg·d)、1 g/(kg·d)、4 g/(kg·d)的2 g/mL金剛藤水煎液，體積分別為0.25 mL、0.1 mL、0.5 mL。建模第8周開始，金剛藤低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃相應劑量的金剛藤水煎液，正常對照組、模型對照組給予10 mL/kg的生理鹽水灌胃，均1次/d，給藥4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 標本采集：末次灌胃后，大鼠禁食，不禁水，12 h后以10%水合氯醛麻醉大鼠,心臟采血，3 500 r/min離心10 min后，取上清液,置于4個EP管中，將EP管置于-80℃冰箱保存待檢。

1.6.2 指標檢測：采用賴氏法檢測ALT、AST、白蛋白、總膽紅素水平；采用酶聯(lián)免疫吸納法檢測透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 5組大鼠血清ALT、AST、ALB、TBIL水平的比較 與正常對照組比較，模型對照組ALT、AST、總膽紅素水平升高，白蛋白水平下降(均P<0.05)。模型對照組、金剛藤低、中、高劑量組ALT、AST、總膽紅素水平依次降低，白蛋白水平依次升高(均P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清ALT、AST、ALB、TBIL水平的比較(x±s)

2.2 5組大鼠血清透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平的比較 與正常對照組比較，模型對照組透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平均升高(均P<0.05)。模型對照組、金剛藤低、中、高劑量組透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原的比較(x±s，ng/mL)

3 討 論

病毒、毒性物質、免疫系統(tǒng)紊亂、寄生蟲感染、過量飲酒等均可導致肝臟損傷，如損傷得不到及時修復則可誘發(fā)肝纖維化。肝纖維化過程是慢性肝損傷的修復反應，表現(xiàn)為細胞外基質的過度沉積[5]，而肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化的中心環(huán)節(jié)。肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)是肝星狀細胞的增生和激活，活化的肝星狀細胞合成大量細胞外基質并沉積，最終導致肝纖維化形成。

ALT主要存在肝細胞內，各種肝炎均可導致ALT水平升高；而肝臟細胞壞死時，線粒體中的AST溢出也可導致血清AST水平升高。因此血清ALT、AST水平可反映肝臟損傷情況。肝臟損傷發(fā)展至一定程度后，其代謝能力下降，導致白蛋白降低，并引起總膽紅素水平升高。本研究結果顯示，模型對照組大鼠ALT、AST、總膽紅素水平高于正常對照組，而白蛋白水平低于正常對照組(均P<0.05)，提示四氯化碳成功誘導大鼠肝細胞損傷。

研究顯示，血清透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平可以用于評估細胞外基質的平衡與降解的動態(tài)過程[6]。其中，透明質酸是肝細胞外基質中的蛋白質多糖，其主要由肝間質成纖維細胞合成、分泌，而大部分由內皮細胞攝取和分解。當肝實質細胞受損，透明質酸出現(xiàn)分解障礙，即肝內間質細胞增生，肝血流受阻使肝竇內皮細胞攝取和分解透明質酸減少；而當發(fā)生肝纖維化時，肝星狀細胞合成大量的透明質酸，但機體清除透明質酸能力下降，造成血清透明質酸升高。LN是肝細胞基底成分中的主要黏蛋白，與膠原、蛋白多糖、糖胺多糖等共同構成細胞外基質。肝纖維化時肝竇中LN過度合成而降解減少，堆積增多，導致血清LN水平升高。高水平的LN在某種程度上能夠反映肝竇毛細血管化的程度和門脈區(qū)纖維化范圍，與肝臟病理損傷程度密切相關[7]。PCⅢ是在細胞外形成原膠原前，被氨基端肽酶切下后進入血液循環(huán)的氨基端尾肽，與Ⅲ型膠原代謝有關。血清PCⅢ水平升高，間接提示肝臟Ⅲ型膠原合成增多。PCⅢ水平與肝纖維化程度密切相關，在肝纖維化早期其水平升高明顯，晚期合成速度減慢，是肝纖維化的活動性指標之一[8]。Ⅳ型膠原是構成基底膜的主要成分，當肝細胞持續(xù)損傷時，在肝臟修復過程中，肝儲脂細胞中用于合成細胞外間質的各組分增加，Ⅳ型膠原過度合成，表現(xiàn)為血清Ⅳ型膠原水平顯著升高，從而促進肝纖維的形成。Ⅳ型膠原水平升高可反映出肝纖維化過程，是肝纖維化早期指標之一[9]。近年來，血清透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平這4項肝纖維化指標，已被認為是預測慢性肝病患者病情進展和治療效果的指標，是評估炎癥活動度、纖維化程度的重要依據。

肝纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學病理形態(tài)學概念，中醫(yī)古籍中無肝纖維化之詞，其分屬“黃疸”“脅痛”“積聚”“臌脹”“肝積”等病證范疇?！督饏T要略·黃疸病脈證并治》曰：“黃家所得，從濕得之”。王振常等[10]認為肝纖維化病位在肝脾腎，基本病機為本虛標實、虛實夾雜，基本病理因素有濕、熱、毒、虛、痰、瘀等。正氣虛弱是內因，濕熱疫毒是外因，痰濁瘀血是病理產物。肝炎病毒作為肝纖維化的主要病因與中醫(yī)濕熱疫毒有相似之處，濕熱與疫毒膠著難去則導致疾病持續(xù)存在和慢性進展。肝藏血，主疏泄，體陰而用陽，濕熱疫毒纏綿難去則可損傷肝臟，導致肝臟氣血失調，瘀阻脈絡，因此血瘀是貫穿始終的病機關鍵，肝纖維化的各個證型都是在此基礎上演變過來的[11]。肝纖維化基本證型為氣陰虛損、瘀血阻絡，根據其臨床表現(xiàn)可分為肝膽濕熱型、肝郁脾虛型、肝腎陰虛型，治療原則為清熱利濕、疏肝健脾、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、滋養(yǎng)肝腎[12]。周語平等[13]研究發(fā)現(xiàn)，治療肝纖維化的中藥以補虛藥、活血化瘀藥、清熱利濕藥居多，且療效較好。而目前對單味藥抗肝纖維化的研究也有一定的進展，主要有丹參、三七、銀杏、黃芪、苦參、半枝蓮等，其抗肝纖維化有效成分多為皂苷類、黃酮類、生物堿類、氨基酸類等[14-15]。金剛藤主要化學成分有黃酮、皂苷、生物堿、氨基酸、有機酸、多糖等，研究表明金剛藤具有清熱利濕、活血化瘀、解毒散結等功效[16]。而根據肝纖維化病因病機、疾病演變過程的特點，以及肝病治療原則主要為扶正固本、疏肝解郁、活血化瘀、清熱利濕，我們認為金剛藤有望用于肝病治療。

本研究結果顯示，模型對照組、金剛藤低、中、高劑量組ALT、AST、總膽紅素水平依次降低，白蛋白水平依次升高(均P<0.05)。提示金剛藤水煎液可減輕肝臟炎癥反應，促進白蛋白合成和提高肝臟對膽紅素代謝能力，且這種作用可能呈劑量依賴性。透明質酸、Ⅳ型膠原是肝纖維化的早期診斷指標,具有比較高的敏感度,而LN是中、晚期肝纖維化的診斷指標,具有比較高的特異性,聯(lián)合檢測這4項指標能夠比較全面反映肝纖維化程度[7]。本研究結果顯示，模型對照組、金剛藤低、中、高劑量組大鼠透明質酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平依次降低(均P<0.05)，提示金剛藤水煎液可改善大鼠肝纖維化程度，且呈劑量依賴性。

綜上所述，金剛藤水煎液可以改善四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠的肝功能及纖維化程度，可能與其減輕肝臟炎癥反應，促進膠原纖維降解，減少細胞外基質在肝臟中沉積有關。