基于慣性聚焦的細(xì)胞計(jì)數(shù)微流控芯片*

張會(huì)寅，郭鐘寧，鄧 宇，黃志剛，鄔澤聿

（1.廣東工業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，廣州 510006；2.廣東工業(yè)大學(xué)省部共建精密電子制造技術(shù)與裝備國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510006；3.廣州市非傳統(tǒng)制造技術(shù)及裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

0 引言

細(xì)胞計(jì)數(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境評(píng)估、食品生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-4]。細(xì)胞計(jì)數(shù)的其中一個(gè)應(yīng)用為牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)。一般情況下，即使是健康的奶牛，生產(chǎn)的牛奶也含有少量乳腺凋亡的細(xì)胞。如果牛奶中的體細(xì)胞濃度增大，那么奶?；既榉垦椎母怕蕦⒋蟠笤黾印６遗Ｄ讨械捏w細(xì)胞增多，對(duì)牛奶的口感和質(zhì)量影響很大[5]。目前細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法有顯微計(jì)數(shù)法、圖像計(jì)數(shù)法[6]、阻抗計(jì)數(shù)法[7]、流式計(jì)數(shù)法[8]等。其中阻抗計(jì)數(shù)法和流式計(jì)數(shù)均為絕對(duì)計(jì)數(shù)，即細(xì)胞逐個(gè)通過檢測位，相關(guān)傳感器檢測到細(xì)胞通過而計(jì)數(shù)。因此如何使細(xì)胞單個(gè)通過檢測位置和精確感應(yīng)單個(gè)細(xì)胞信號(hào)是細(xì)胞計(jì)數(shù)精度的關(guān)鍵。

微流控芯片即芯片上的實(shí)驗(yàn)室，力圖將傳統(tǒng)檢測微型化、自動(dòng)化、便攜化。微流控技術(shù)中，有一種被動(dòng)粒子控制技術(shù)叫慣性聚焦，帶有微米級(jí)粒子通過設(shè)計(jì)的流道即可實(shí)現(xiàn)粒子的排序。然而慣性聚焦對(duì)粒子大小的選擇性較大，不同粒徑大小的粒子在同一流速下，通常聚焦的位置是不一樣的，因此很多人利用這一特性進(jìn)行粒子分選。也有人提出使用慣性聚焦作為細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞聚焦方式，研究單一粒徑的微粒子模擬細(xì)胞聚焦的可行性[9]。然而一般情況下細(xì)胞的大小是有差別的，單一粒徑微球的聚焦模擬實(shí)驗(yàn)并不能完全代表實(shí)際情況。

本文根據(jù)細(xì)胞大小及慣性聚焦理論設(shè)計(jì)慣性聚焦微流道，然后以極限尺寸以及平均細(xì)胞大小的聚苯乙烯微顆粒探究聚焦規(guī)律。利用得出的單一粒子的聚焦規(guī)律，選擇合適的流速，用混合粒子驗(yàn)證聚焦效果。

1 慣性聚焦理論及流道設(shè)計(jì)

慣性聚焦分直線慣性聚焦和彎道慣性聚焦。由于直線慣性聚焦的平衡位置一般為多個(gè)[10]，而彎道慣性聚焦存在二次流，平衡位置只有一個(gè)[11]。因此為實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞通過檢測位置，彎道慣性聚焦較合適。彎道慣性聚焦中，有螺旋型[12]、正弦型[11]、方波型[13]等聚焦流道。由于螺旋型聚焦流道設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，方波型聚焦流道比較適合粒子分離，因此本文嘗試采用正弦型流道作為多粒子聚焦流道。

1.1 慣性聚焦理論

正弦型流道聚焦流道COMSOL流場仿真截面如圖1（a）所示，可以看到垂直于截面的速度場左右流速不對(duì)稱，左側(cè)的速度梯度大于右側(cè)。除了垂直截面的速度，還存在截面方向的速度，如圖中箭頭所示。粒子在這樣非對(duì)稱慣性聚焦流道中，受到由速度梯度和壁面的作用形成的慣性升力FL，以及由二次流作用產(chǎn)生的斯托克斯曳力，也稱迪恩曳力FD[11]，如圖1（b）所示。其中慣性升力FL的表達(dá)式如下：

式中：ρ為流體密度；Um為流道中最高流速；CL為升力系數(shù)，和粒子在流道截面中的位置有關(guān)；a為粒子直徑；Dh為流道水力直徑。

圖1 COMSOL流場仿真流速分布和粒子在二次流中受力示意圖

迪恩曳力FD的表達(dá)式如下：

式中： μ為流體的動(dòng)力黏度；UD為二次流的平均流速；a為粒子的直徑。

影響粒子聚焦的力主要為以上兩個(gè)力，而這兩個(gè)力的大小和粒子所處的位置相關(guān)，當(dāng)慣性升力和迪恩曳力相等，則此時(shí)粒子所處的位置就是粒子的平衡位置。

1.2 流道設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)表明，粒子直徑a和流道的水力直徑Dh需要滿足以下條件才能實(shí)現(xiàn)粒子聚焦[11]。

式中：w為流道寬度；h為流道深度。

對(duì)于直徑為7μm、10μm、12μm的微球，設(shè)計(jì)了如圖2所示流道，深度為50μm，大彎道平均半徑和寬度為665μm和400μm，小彎道平均半徑和寬度為200μm和200μm。高速攝影位置為如圖2所示聚焦末端。

圖2 流道示意圖

2 聚焦實(shí)驗(yàn)

2.1 單一粒徑粒子實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

用聚苯乙烯微球模擬細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。聚苯乙烯微球?yàn)樘旖蚴斜端紭飞V技術(shù)開發(fā)中心的Unibead單分散相聚苯乙烯微球。正常牛奶體細(xì)胞濃度為20萬個(gè)/mL～30萬個(gè)/mL[5]。分別將7μm、10μm、12μm配置為25萬個(gè)/mL，然后分別以50μL/min的速度梯度，從100μL/min到1 000μL/min注射微顆粒。高速攝影儀拍攝視頻，采集頻率4 000 Fps，曝光時(shí)間15μs，然后用ImageJ疊加視頻幀，觀察相應(yīng)速度粒子的位置分布情況。

圖3所示為7μm微球在高速攝影視頻幀疊加圖，在流速小于550μL/min時(shí)，微顆粒沒有形成可靠聚焦；微顆粒完全離散或者少量游離于聚焦軌道。當(dāng)流速大于或等于550 μL/min時(shí)，粒子可靠聚焦。圖4所示為10μm微球在高速攝影視頻幀疊加圖，在流速小于500μL/min時(shí)，微顆粒沒有形成可靠聚焦；微顆粒完全離散或者少量游離于聚焦軌道。當(dāng)流速大于或等于500μL/min時(shí)，粒子可靠聚焦。圖5所示為12μm微球在高速攝影視頻幀疊加圖，在流速小于350μL/min時(shí)，微顆粒沒有形成可靠聚焦；微顆粒完全離散或者少量游離于聚焦軌道。當(dāng)流速大于或等于350μL/min時(shí)，粒子可靠聚焦。

圖3 7μm聚苯乙烯微球高速攝影視頻幀疊加圖

圖4 10μm聚苯乙烯微球高速攝影視頻幀疊加圖

圖5 12μm聚苯乙烯微球高速攝影視頻幀疊加圖

在正弦型聚焦流道的單一直徑粒子聚焦中，聚焦的本質(zhì)為粒子在流體中，慣性升力和迪恩曳力的平衡，而平衡位置只有一個(gè)。單一粒子的聚焦，粒子軌道相同，而且粒子不可能同時(shí)存在同一位置，因此粒子與粒子之間存在相互作用，使得粒子之間總是存在一定的間距。因此，為進(jìn)一步說明聚焦的聚焦效果，如圖6所示，本文定義了聚焦寬度和聚焦軌道位置為評(píng)價(jià)粒子聚焦效果，聚焦寬度為視頻幀疊加圖的疊加軌跡寬度；聚焦位置為聚焦中心到流道內(nèi)側(cè)的距離。使用ImageJ的Plot Profile功能對(duì)視頻幀疊加圖進(jìn)行灰度分析。測量粒子軌跡的寬度以及聚焦中心位置，測量出來的寬度以及中心位置趨勢如圖7和圖8所示。

圖6 聚焦寬度d和聚焦位置h示意圖

圖7 流速與微球粒徑對(duì)聚焦寬度的影響

圖8 流速與微球粒徑對(duì)聚焦中心位置的影響

聚焦寬度趨勢如圖7所示，在可以實(shí)現(xiàn)微顆?？煽烤劢沟牧魉傧拢S著流速的增加，7μm、10μm、12μm的微粒子聚焦的寬度均有成線性變寬的趨勢。其中7μm微球聚焦寬度變化率最大，流速從550μL/min變化到1 000μL/min，微球聚焦寬度從23.99μm變化到55.1μm；10μm微球聚焦寬度變化率次之，流速從500μL/min變化到1 000μL/min，寬度從27.3μm變化到39.9μm；12μm寬度變化率最小，流速從350μL/min變化到1 000μL/min，微球聚焦寬度從19.6μm變化到34.5μm，聚焦寬度基本保持恒定。

聚焦位置趨勢如圖8所示，在可以實(shí)現(xiàn)微顆粒可靠聚焦的流速下，無論粒徑大小，粒子聚焦軌道的中心位置明顯有隨流速的增大而線性增大的趨勢。這是因?yàn)楫?dāng)流速增大，由于二次流的流速增大，由式（2）可知，迪恩曳力會(huì)增大。由式（1）可知，慣性升力的大小除了和流速有關(guān)以外，還和升力系數(shù)相關(guān)，升力系數(shù)在一定范圍內(nèi)，偏離側(cè)壁距離越大，系數(shù)越大[14]，因此平衡位置會(huì)隨著流速增大而偏離內(nèi)側(cè)壁。

2.2 混合粒子實(shí)驗(yàn)

相對(duì)于單一粒子聚焦，多粒子聚焦由于粒徑的差異導(dǎo)致聚焦軌道出現(xiàn)差異，另外粒子之間的距離要盡量大，而粒子之間的距離產(chǎn)生原因?yàn)橥卉壍郎狭Ｗ又暗南嗷プ饔?。因此?duì)于多粒子聚焦要使得粒子的聚焦軌道差異盡量小，聚焦寬度盡量小，才能很好地控制粒子之間的距離。結(jié)合圖7和圖8，將3種粒子的軌道進(jìn)行疊加，得到如圖9所示的粒子軌道疊加寬度圖。在流速為550μL/min時(shí)，此時(shí)軌道最能滿足軌道相近，聚焦寬度小的條件。在這個(gè)流速下，3個(gè)軌道疊加的寬度為32.213μm，聚焦位置為51.907μm。

混合3種粒徑的粒子，以550μL/min流速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。觀測粒子的聚焦情況，與單一粒子聚焦疊加軌道進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)效果圖10所示。圖10（a）為高速攝影儀拍攝的視頻幀，可以看到，粒子可以實(shí)現(xiàn)粒子間距拉開。圖10（b）為高速攝影儀拍攝的視頻幀疊加圖，可以看到，粒子可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定聚焦，穩(wěn)定聚焦的寬度為32.8μm，聚焦位置為51.45μm，和單一粒子聚焦軌道的疊加相近。

圖9 粒子軌道疊加寬度圖

圖10 混合粒子聚焦實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)束語

采用實(shí)驗(yàn)方法，研究單一粒子在慣性聚焦流道中，不同流速的情況下，粒子的聚焦寬度及聚焦軌道位置。另外混合多種粒子實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了多粒子在同一慣性聚焦流道聚焦的可行性。

（1）同一粒子在同一慣性聚焦流道中聚焦，流速到達(dá)一定值才能實(shí)現(xiàn)可靠聚焦；粒子直徑越小，需要的流速越高；流速越高，粒子的聚焦寬度越大；聚焦的中心位置，越偏離流道內(nèi)側(cè)壁。

（2）混合粒子在設(shè)計(jì)的流道能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定間距聚焦，其軌道可以通過粒子單一粒子的軌道的疊加預(yù)測聚焦軌道和寬度。和傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)流道相比，本流道可以實(shí)現(xiàn)鞘液聚焦的效果，為細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)提供基礎(chǔ)，省去鞘液的注射，簡化細(xì)胞計(jì)數(shù)液路。