果酸聯(lián)合調(diào)q激光治療中波紫外線誘導(dǎo)黃褐斑鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

賈曉敏，陳偉，譚文，蔣甜甜，廖陽英，唐樺，馮浩

[1.西藏自治區(qū)拉薩市人民醫(yī)院 病理科，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)，西藏 拉薩850000；3.長沙市中醫(yī)醫(yī)院 病理科，湖南 長沙 410111；4.湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院 （湖南省人民醫(yī)院） 皮膚科，湖南 長沙 410005]

黃褐斑是一種常見的后天色素沉著性皮膚病，常表現(xiàn)為對(duì)稱網(wǎng)狀色素沉著，顏色深淺不一，易復(fù)發(fā)，好發(fā)于女性。臨床上50%～80%患者易發(fā)于面中部[1]，主要影響美觀，增加患者心理壓力，降低患者生活質(zhì)量。黃褐斑病因尚未明確，研究認(rèn)為可能與遺傳易感性、日曬、內(nèi)分泌因素、長期攝入某些藥物、微量元素缺乏、精神因素等相關(guān)[2]。目前治療方法多樣，各種外用藥物 （如：氫醌、果酸） 、系統(tǒng)用藥 （如：氨甲環(huán)酸、維生素C） 、光學(xué)治療 （如：強(qiáng)脈激光、調(diào)q激光） 均取得一定的療效，但仍有限[3]，且目前相關(guān)治療主要以臨床研究為主，缺少相關(guān)機(jī)制研究。本研究主要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究果酸聯(lián)合調(diào)q激光治療中波紫外線誘導(dǎo)的黃褐斑鼠模型的療效，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雌性豚鼠30只，6～8周齡，體重250～300 g，由湖南太平洋生物科技有限公司提供，黃體酮注射液 （規(guī)格1 ml：20 mg） 購自廣州白云山明興制藥有限公司，戊巴比妥鈉注射液購自廣東邦民制藥廠有限公司，果酸、果酸無菌刷、果酸中和液 （1%碳酸氫鈉溶液） 購自薇諾娜公司，3%氫醌乳膏購自廣東人人康藥業(yè)有限公司，超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 試劑盒及丙二醛 （Malondialdehyde，MDA） 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，HMB45鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型復(fù)制、治療

隨機(jī)將30只豚鼠分為正常組 （6只）和實(shí)驗(yàn)組 （24只），選取背部約3 cm×3 cm 皮膚剃毛備用。正常組不予以特殊處理；實(shí)驗(yàn)組參照文獻(xiàn)[4-5]模型復(fù)制的方法，于豚鼠后腿根部屈側(cè)肌內(nèi)注射黃體酮與0.9%氯化鈉注射液混合液 （1∶1），20 mg/kg，1次/d，左右腿交替，連續(xù)注射30 d，同時(shí)每日予以波長280～320 nm的中波紫外線 （上海季光特種照明電器有限公司紫外線燈） 照射背部裸露的皮膚 （紫外燈距離豚鼠背部約20 cm），1次/d，60 min/次，共30 d，復(fù)制黃褐斑鼠模型。隨機(jī)挑選實(shí)驗(yàn)組及正常組豚鼠各6只，抽取心臟血行SOD和MDA檢測，取背部約1.0 cm×1.0 cm 皮損處全層皮膚組織，行HE和免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)組余18只為模型組，隨機(jī)分為A、B、C組，每組6只。A組予以果酸聯(lián)合調(diào)q激光治療，初始選用20%的果酸[6]，均勻涂抹于皮損處，停留3～5 min 并密切觀察皮膚反應(yīng)后，使用1%碳酸氫鈉中和液中和，再冷噴20 min，2 周后采用調(diào)q激光治療，波長1 064 nm，能量1.3～2.4 J/cm2，光斑半徑為5 mm，治療頭垂直皮膚表面，平行均勻掃描患處3或4次，1個(gè)月為1個(gè)療程，共4個(gè)療程，果酸濃度依次為20%、35%、50%、70%[7]；B組于黃褐斑鼠背部病灶皮損處涂抹3%氫醌軟膏，1次/d；C組不做任何特殊處理。4個(gè)月后進(jìn)行檢測。

1.3 血清及皮膚、肝臟組織勻漿的制備

于心臟處抽取血液5 ml，離心，獲取血清。隨后分離出皮損組織及肝臟組織，用預(yù)冷4℃的0.9%氯化鈉NaCl 溶液漂洗，濾紙拭干，稱重，皮膚和肝臟組織各約0.5 g，將組織剪碎，置于勻漿器中加入0.9% NaCl溶液約4.5 g，將其研磨制備成10%的組織勻漿，隨后將勻漿液離心，取上清液進(jìn)行檢測[8]。

1.4 血清及皮膚、肝臟組織SOD、MDA檢測

血清及皮膚、肝臟組織SOD、MDA的測定按試劑盒操作要求進(jìn)行，采用分光光度法測定樣品管的吸光度值，檢測SOD、MDA水平[9]。

1.5 皮膚組織病理學(xué)檢測

HE染色病理標(biāo)本切片制備：取各組豚鼠皮損部位全層皮膚，約1.0 cm×1.0 cm，隨即放入10%中性甲醛進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片、HE染色，觀察皮膚的組織病理學(xué)變化。免疫組織化學(xué)染色：選用SP法標(biāo)記黑色素細(xì)胞，一抗選用鼠抗人單克隆抗體HMB45，己二酸二丁酯 （DAB） 顯色，蘇木精復(fù)染。用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組與模型組皮損表現(xiàn)

正常組豚鼠背部皮膚呈均勻的淺棕色；模型組黃褐斑鼠背部模型復(fù)制區(qū)域皮膚呈均一穩(wěn)定、邊界清晰的深褐色色斑。見圖1。

2.2 正常組與模型組皮損病理組織學(xué)形態(tài)變化

正常組豚鼠表皮的鱗狀上皮層細(xì)胞排列整齊，較菲薄，由排列整齊的基底細(xì)胞和棘細(xì)胞組成，2或3層，真皮層內(nèi)未見微小血管擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞少見；模型組黃褐斑鼠表皮的鱗狀上皮層細(xì)胞明顯增生，核大且排列紊亂，真皮層內(nèi)可見小血管增生擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞多見，基底層可見連續(xù)分布的黑素顆粒。見圖2。

圖1 皮損表現(xiàn)

2.3 正常組與模型組上皮層內(nèi)黑色素細(xì)胞的分布

正常組豚鼠上皮層內(nèi)可見少許黑色素細(xì)胞，主要分布于基底層，胞漿著色棕褐色；模型組黃褐斑鼠上皮層內(nèi)可見大量黑色素細(xì)胞，成簇分布于基底層和棘層，胞漿著色深褐色，伴細(xì)胞核增大及核上移，表皮細(xì)胞數(shù)增多。見圖3。

2.4 正常組與模型組血清MDA、SOD水平比較

兩組MDA和SOD水平的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），模型組血清MDA水平上升，SOD水平下降。見表1。

2.5 模型組治療前后皮損比較

模型組治療前皮損處均可見均一穩(wěn)定、邊界清晰的深褐色斑。A組治療后可見皮膚稍淡紅，無明顯色素沉著；B組治療后可見皮膚顏色變淺，僅有局部小片色素沉著，治療過程中皮膚偶有干燥、脫屑；C組治療后肉眼可見皮膚色素稍減退，但仍明顯區(qū)別于正常皮膚。見圖4。

圖2 皮膚病理改變 （HE染色×100）

圖3 上皮層內(nèi)黑色素細(xì)胞的分布改變 （SP法×400）

表1 模型組與正常組血清MDA及SOD比較 （n=6，±s）

表1 模型組與正常組血清MDA及SOD比較 （n=6，±s）

組別 MDA/nmol SOD/u正常組 2.922±0.514 268.935±4.845模型組 7.758±1.168 196.687±7.062 t值 9.283 20.671 P值 0.000 0.000

圖4 模型組治療前后皮損比較

2.6 模型組治療后皮損HE染色結(jié)果

A組和B組豚鼠表皮的上皮層細(xì)胞增生有所減輕，排列整齊，真皮層內(nèi)微小血管擴(kuò)張減輕，炎癥細(xì)胞浸潤少見，黑色素細(xì)胞分辨不清晰；C組豚鼠表皮的上皮層細(xì)胞明顯增生，核大且排列紊亂，真皮層內(nèi)仍可見微小血管擴(kuò)張?jiān)錾装Y細(xì)胞浸潤多見，基底層可見黑色素細(xì)胞連續(xù)分布。見圖5。

2.7 模型組治療后皮損免疫組織化學(xué)結(jié)果

A組和B組黃褐斑鼠上皮基底層可見胞漿著色為深褐色的黑色素細(xì)胞，棘層及角質(zhì)層未見黑色素細(xì)胞，黑色素細(xì)胞呈線狀或散在分布；C組豚鼠上皮基底層和棘層仍可見大量黑色素細(xì)胞，胞漿著色深褐色，黑色素細(xì)胞堆積，呈層狀分布。見圖5。

2.8 模型組治療后SOD、MDA水平比較

治療干預(yù)后，A、B、C組血清SOD和MDA，肝臟SOD和MDA，皮膚SOD和MDA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。治療后A、B組與C組比較，血清SOD活力上升 （t=10.419和11.824，均P=0.000） ；A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.323，P=0.753）。A、B組血清MDA水平均較C組下降 （t=6.014和4.153，均P=0.002） ；A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=4.304，P=0.155）。A、B兩組肝臟SOD活性較C組上升 （t=8.760和11.082，均P=0.000） ；A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.756，P=0.467）。A、B兩組肝臟MDA水平較C組下降 （t=0.782和0.429，P=0.042和0.003） ；A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=1.592，P=0.142）。A、B兩組皮膚SOD活性較C組升高 （t=3.028和4.385，P=0.013和0.001） ；A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=0.197，P=0.847）。皮膚MDA水平A、B組低于C組 （t=5.719和4.825，均P=0.000） ；A、B兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=1.359，P=0.204）。見表2。

圖5 模型組治療后皮損染色結(jié)果 （×400）

表2 各組治療后血清、肝臟和皮膚組織中SOD及MDA的水平比較 （±s）

表2 各組治療后血清、肝臟和皮膚組織中SOD及MDA的水平比較 （±s）

注：①與C組比較，P＜0.05；②與B組比較，P＞0.05。

組別血清 肝臟 皮膚SOD/u MDA/nmol SOD/u MDA/nmol SOD/u MDA/nmol A組 236.13±4.52①② 5.21±0.23①② 100.53±3.81①② 0.44±0.12①② 28.51±6.54①② 0.06±0.02①②B組 235.35±3.81① 5.82±0.26① 99.28±1.38① 0.57±0.16① 27.96±1.94① 0.08±0.03①C組 216.74±0.59 7.23±0.79 81.71±3.63 0.73±0.90 18.31±5.03 0.23±0.07 F值 161.120 42.620 108.150 25.210 194.160 107.920 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

黃褐斑是一種以面部色素沉著為主的損容性疾病，多發(fā)于育齡期女性，對(duì)患者的容貌、心理造成一定影響，治療起來難度較大，復(fù)發(fā)率很高。黃褐斑的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為是由多種因素導(dǎo)致黑色素細(xì)胞中黑色素過量表達(dá)及代謝障礙所致[10]。黑色素的形成與脂質(zhì)過氧化和酪氨酸酶密切相關(guān)。人體在應(yīng)激狀態(tài)下或紫外線刺激時(shí)，可使體內(nèi)氧自由基增多，SOD 相對(duì)不足，導(dǎo)致過多的氧自由基與真皮層細(xì)胞產(chǎn)生氧化反應(yīng)，形成大量的脂褐素，形成黃褐斑[11]。目前黃褐斑的治療方式多種多樣，果酸及調(diào)q激光在臨床上的應(yīng)用均取得一定療效，但兩者聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道相對(duì)較少。

果酸化學(xué)名稱為乙醇酸，是目前突出的化學(xué)剝脫試劑的主要成分，在治療色素沉著性皮膚問題方面受到越來越多的關(guān)注[12]。果酸治療黃褐斑見效較慢，且對(duì)深層的色素療效欠佳。就其作用機(jī)制而言，較多的關(guān)注在于其化學(xué)剝脫作用，其他可能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。調(diào)q激光可以調(diào)節(jié)波長控制治療深度，在不影響周圍組織的情況下，選擇性地破壞黑素體。但調(diào)q激光的缺點(diǎn)是靶組織吸收少，爆破不夠，單一提高能量，對(duì)周邊皮膚組織及基膜會(huì)造成損害，有增加色素沉著的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。故單一使用果酸或調(diào)q激光均有一定局限性。

因此，本研究聯(lián)合2種治療方法治療黃褐斑鼠。結(jié)果顯示不同濃度的果酸聯(lián)合調(diào)q激光周期性干預(yù)治療黃褐斑鼠后，肉眼觀色素沉著基本消退。HE染色可見表皮的上皮層細(xì)胞增生、排列紊亂及真皮層內(nèi)微小血管擴(kuò)張明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示表皮黑色素細(xì)胞呈線狀或散在分布，相對(duì)于自然恢復(fù)對(duì)照組，黑色素細(xì)胞及黑色素顆粒明顯減少。均提示黃褐斑明顯改善。果酸聯(lián)合調(diào)q激光治療后血清、肝臟、皮膚組織的MDA水平降低，SOD水平升高，提示治療的同時(shí)又明顯有抗氧化作用。故結(jié)合果酸及調(diào)q激光的治療特點(diǎn)，考慮果酸還有一定的抗氧化性，能促使SOD水平升高，MDA水平降低，抑制機(jī)體內(nèi)過氧化程度，從而使黑色素細(xì)胞的生成減少，減少皮膚的色素沉著。

綜上所述，果酸聯(lián)合調(diào)q激光治療黃褐斑效果顯著，其機(jī)制可能與果酸的剝脫作用、抗氧化作用，以及調(diào)q激光選擇性破壞黑色素細(xì)胞、減少黑色素生成有關(guān)。