C57BL/6小鼠p38絲裂原活化蛋白激酶通路抑制后抗結(jié)核效應(yīng)

盛青 黃麗軍 鄒威鳳 周強(qiáng) 周曉婷 祝濤

1廣州市胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科（廣州510095）；2宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江西宜春336000）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosi，MTB）感染引起的慢性傳染性疾病，以肺結(jié)核最為常見。最新數(shù)據(jù)顯示，2018年全球大約有1 040萬新發(fā)結(jié)核病例[1]，表明結(jié)核病仍然是威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。眾所周知，在MTB感染過程中，宿主分泌的細(xì)胞因子在介導(dǎo)其對MTB的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，如MTB感染的巨噬細(xì)胞可分泌炎癥因子，介導(dǎo)肉芽腫形成和T細(xì)胞免疫反應(yīng)[2]。在宿主介導(dǎo)MTB感染的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是重要的細(xì)胞信號通路之一，其包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、p38 MAPK和c-Jun N-末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）[3]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)[4]：在肺結(jié)核患者和肺結(jié)核小鼠模型中p38 MAPK的磷酸化水平均顯著增加，在巨噬細(xì)胞中p38 MAPK表達(dá)水平隨感染時(shí)間的推移而逐步增高，提示磷酸化活化的p38 MAPK信號重要參與了抗結(jié)核感染過程。為進(jìn)一步認(rèn)識該信號通路在抗結(jié)核感染中的作用，本研究對應(yīng)用p38 MAPK 抑制劑（SB203580）抑制小鼠內(nèi)p38 MAPK 通路后的抗結(jié)核作用進(jìn)行了初步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物SPF級8～10周齡雄性C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量（20±0.8）g，由深圳第三人民醫(yī)院肝病研究所提供。

1.1.2 主要儀器和試劑紅細(xì)胞裂解液（Invitrogen），1640 培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），結(jié)核菌株H37Rv（廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核病生物樣本庫保存株），熒光PCR 儀（Roche），紫外分光光度儀（DeNovix），普通PCR 儀（ABI），高速離心機(jī)（Eppendorf），流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoⅡ），SB203580（Invitrogen），氣溶膠感染裝置（Glas-Col），細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海合恒儀器設(shè)備有限公司），鼠抗CD11b APC（eBioscience），鼠抗F4/80 FITC（eBioscience），鼠抗Ly6G APC-CY7（eBioscience）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠結(jié)核病模型構(gòu)建p38 MAPK 抑制劑（SB203580）用DMSO 溶解，且終濃度用DMSO 稀釋成2 mg/mL，將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別通過腹腔注射DMSO（對照組）和SB203580（觀察組），并做好標(biāo)記；將小鼠通過氣溶膠霧化吸入系統(tǒng)感染約150 CFUs的有毒菌株H37Rv，30 d后處死小鼠[5]，收集小鼠肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和肝臟等組織進(jìn)行細(xì)菌載量計(jì)數(shù)，檢測小鼠肺組織炎癥細(xì)胞比例、細(xì)胞因子表達(dá)水平以及CD4+、CD8+、CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T細(xì)胞亞群比例。

1.2.2 小鼠細(xì)菌載量計(jì)數(shù)收集小鼠完整的各組織并放置于盛有4.5 mL生理鹽水的離心管中，采用勻漿器勻漿組織片刻，使不見組織碎片為準(zhǔn)，重懸后取500 μL組織勻漿液加入另一盛有4.5 mL 無菌生理鹽水的離心管中，梯度稀釋后分別取100 μL組織勻漿液接種至Middlebrook 7H11 羅氏平板中，輕輕搖勻后放置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 周左右后計(jì)數(shù)平板中菌落數(shù)，并計(jì)算各組織的細(xì)菌載量。

1.2.3 肺組織淋巴細(xì)胞的分離收集小鼠肺組織并剔除淋巴結(jié)，將小鼠肺組織剪成勻漿狀，用Ⅳ型膠原酶混勻后37℃消化30 min，移出吹打片刻，再放置于37℃培養(yǎng)箱20 min，消化后加入12.5 mmol/L EDTA 冰上終止消化5 min，將上述制備的肺組織細(xì)胞懸液通過細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，制備單細(xì)胞懸液，在4℃，2 000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞后加入3 mL 38%Percoll淋巴細(xì)胞分離液重懸混勻，在4℃，2 000 r/min，離心30 min，收集細(xì)胞見紅細(xì)胞可加入1 mL 紅細(xì)胞裂解液常溫裂解5 min，裂解后加滿PBS 至15 mL，以終止裂解反應(yīng)并在4℃，2 000 r/min，離心5 min，棄細(xì)胞上清，加入2 mL RPMI 1640/5%FBS 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將所獲得的細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)[6]。

1.2.4 流式檢測術(shù)將鼠抗CD11b APC，鼠抗F4/80 FITC和鼠抗Ly6G APC-CY7等抗體以400倍稀釋，避光放置于冰上。取1 mL 細(xì)胞懸液，5 000 r/min，離心5 min，棄細(xì)胞上清，加入100 μL 抗體稀釋液，重懸后避光孵育15 min，孵育后加入1 mL PBS常規(guī)離心，棄上清，用100 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.2.5 qRT-PCR檢測將組織勻漿液根據(jù)Total RNA Kit I試劑說明書抽提RNA 并利用紫外分光光度儀檢測提取純度；RNA 被反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在熒光PCR 儀上檢測基因的Ct值，并與內(nèi)參基因GAPDH 對比，計(jì)算各基因的相對函數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以DMSO 對照組和SB203580 觀察組小鼠肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和肝臟等組織的細(xì)菌載量，以及炎癥細(xì)胞比例、細(xì)胞因子表達(dá)水平和CD4+、CD8+、CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T細(xì)胞亞群比例以x±s表示，正態(tài)分布資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和觀察組小鼠各組織中細(xì)菌載量的變化本組研究結(jié)果顯示，觀察組小鼠肺、淋巴結(jié)、脾臟和肝臟等組織細(xì)菌載量均明顯多于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 對照組和觀察組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度的變化研究顯示除CD4+、CD8+以及CD8+IFNγ+T細(xì)胞外，觀察組小鼠肺組織單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+IFN-γ+T細(xì)胞均顯著低于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2），提示p38 MAPK 活性被抑制后小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤程度發(fā)生了重要變化。

表1 小鼠各組織中細(xì)菌載量情況Tab.1 The circumstances of bacterial load in various tissues of mice ±s

表1 小鼠各組織中細(xì)菌載量情況Tab.1 The circumstances of bacterial load in various tissues of mice ±s

組別觀察組對照組t值P值肺6.21±0.04 5.76±0.05 7.593 0.000 2淋巴結(jié)5.11±0.07 4.16±0.05 4.700 0.001 5脾4.91±0.06 3.96±0.05 5.868 0.000 2肝4.11±0.07 3.46±0.05 3.178 0.009 9

2.3 對照組和觀察組小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)水平的變化在發(fā)現(xiàn)觀察組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤顯著低于對照組之后，我們進(jìn)一步檢測小鼠肺組織炎癥因子的表達(dá)水平，研究顯示：相對于內(nèi)參基因，觀察組小鼠肺組織TNF-α、IL-12P40、IL-17A、IFN-γ、CXCL1、CXCL5和CXCL15 基因表達(dá)水平均明顯低于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 小鼠肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤情況Tab.2 The ratio of inflammatory cell infiltration in lung tissue of mice ±s，%

表2 小鼠肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤情況Tab.2 The ratio of inflammatory cell infiltration in lung tissue of mice ±s，%

組別觀察組對照組t值P值單核細(xì)胞1.82±0.21 2.71±0.31 4.221 0.001 8中性粒細(xì)胞4.01±1.68 7.11±1.88 3.084 0.011 6巨噬細(xì)胞1.92±0.60 3.42±0.68 5.007 0.000 5 CD4+T細(xì)胞31.23±2.44 31.95±1.69 0.241 5 0.814 1 CD8+T細(xì)胞59.95±2.98 59.23±1.38 0.218 4 0.831 5 CD4+IFN-γ+T細(xì)胞0.48±0.09 1.22±0.11 5.248 0.000 4 CD8+IFN-γ+T細(xì)胞0.25±0.06 0.19±0.03 0.871 4 0.404 0

表3 小鼠肺組織中炎癥因子表達(dá)水平情況（相對于內(nèi)參基因）Tab.3 Expression levels of inflammatory factors in mouse lung tissue（relative to the reference gene）±s

表3 小鼠肺組織中炎癥因子表達(dá)水平情況（相對于內(nèi)參基因）Tab.3 Expression levels of inflammatory factors in mouse lung tissue（relative to the reference gene）±s

組別觀察組對照組t值P值TNF-α 0.52±0.07 1.02±0.11 3.893 0.003 7 IL-12P40 0.40±0.07 1.03±0.14 4.458 0.001 6 IL-17A 0.32±0.08 1.11±0.25 3.012 0.016 8 IFN-γ 0.46±0.03 1.01±0.08 7.006＜0.000 1 CXCL1 0.59±0.14 1.17±0.14 2.917 0.017 15 CXCL5 0.37±0.21 1.27±0.30 2.500 0.033 8 CXCL15 0.41±0.09 1.08±0.26 2.855 0.021 3

3 討論

人體抗結(jié)核免疫涉及各細(xì)胞群體間的一系列復(fù)雜相互作用[7]，各類免疫細(xì)胞對感染結(jié)核分枝桿菌的吞噬與殺滅[8]、由各種免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子所策動(dòng)的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用可以控制感染[9]，而由趨化因子所衍生的變態(tài)反應(yīng)則可使感染局限化[10-11]。本研究結(jié)果顯示C57BL/6小鼠的p38 MAPK 通路被其抑制劑SB203580 阻斷后，在組織水平、細(xì)胞水平和相關(guān)分子水平上，對結(jié)核分枝桿菌感染的反應(yīng)均表現(xiàn)出重要的變化：小鼠肺組織單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+IFN-γ+T細(xì)胞在數(shù)量上大為減少，小鼠肺組織TNF-α、IL-12P40、IL-17A、IFN-γ、CXCL1、CXCL5和CXCL15表達(dá)水平大為降低，而最終呈現(xiàn)出小鼠肺、淋巴結(jié)、脾、肝等重要臟器的結(jié)核分枝桿菌載量較通路非抑制小鼠大幅升高，這些變化深刻表明p38 MAPK 通路在機(jī)體抗結(jié)核免疫中有著重要的作用。

從機(jī)體抗結(jié)核免疫的分子層面看，有研究揭示[12-13]：p38 MAPK 可重要影響分枝桿菌早期分泌蛋白ESAT6 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)水平，p38 MAPK 被抑制后MCP-1、TNF-α的表達(dá)水平明顯降低。而MCP-1、TNF-α是結(jié)核病免疫和結(jié)核性肉芽腫形成過程中的重要分子[14]，與本研究結(jié)果一致，即抑制p38 MAPK通路會降低感染機(jī)體的抗結(jié)核能力。YAO 等[1]的研究指出結(jié)核分枝桿菌Rv2346c 通過抑制通過p38/miRNA/NF-κB 途徑產(chǎn)生的TNF-α和IL-6 來增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)的分枝桿菌存活，則和本研究的觀察組小鼠肺、淋巴結(jié)、脾、肝等重要臟器的結(jié)核分枝桿菌載量較對照小鼠大幅升高的結(jié)果相吻合。

對于結(jié)核病免疫，有學(xué)者歸結(jié)為由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等發(fā)揮重要作用的固有免疫應(yīng)答，以及由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞進(jìn)行抗原提呈、眾多細(xì)胞因子重要參與、各類淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[15-16]。從中可以看到中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和各類淋巴細(xì)胞均重要參與其中，MOGUCHE 等[17]、GRANT 等[18]還指出淋巴細(xì)胞的分化路徑也深刻影響機(jī)體抗結(jié)核免疫結(jié)局，本文觀察組小鼠肺組織單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+IFN-γ+T細(xì)胞在數(shù)量上大為減少的研究結(jié)果印證了這些結(jié)論。

另外，p38 MAPK 通路的抑制對小鼠抗結(jié)核作用的抑制涉及到小鼠肺、淋巴結(jié)、脾、肝等重要臟器，說明其影響是全身性的。本研究對小鼠肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤情況和相關(guān)因子表達(dá)水平進(jìn)行了較為深入地研究，基本闡明了小鼠肺臟結(jié)核分枝桿菌載量與其肺部免疫功能密切相關(guān)。但是，對于觀察組小鼠淋巴結(jié)、脾、肝等器官的結(jié)核分枝桿菌的載量增加，是源自這些器官的免疫功能降低，還是因?yàn)榉谓M織結(jié)核分枝桿菌載量增加后細(xì)菌的繁殖擴(kuò)張效應(yīng)所致，則有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，結(jié)合筆者的前期研究[4]，從p38 MAPK 通路激活與抑制兩個(gè)相對的方面證實(shí)了該通路在抗結(jié)核免疫中的重要作用，這將為抗結(jié)核新疫苗的研發(fā)和抗結(jié)核新藥的研制提供新的方向。