持續(xù)血漿趨化因子C-X-C基序配體12增加導(dǎo)致疼痛的慢性化

張輝 麥春林 許雅南 林震嘉 揭英桃 熊媖 唐源 劉先國 談智 周利君

1廣東省第二人民醫(yī)院麻醉科（廣州510317）；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室及中山大學(xué)疼痛研究中心（廣州510080）

急性痛對機(jī)體具有保護(hù)和預(yù)警作用，但控制不當(dāng)就會轉(zhuǎn)化為慢性痛而成為一種疾病[1]。慢性痛在我國社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)中位居第三[2]，其中外周神經(jīng)損傷疾病或胸外科等術(shù)后引起的神經(jīng)病理性疼痛較為常見，其主要表現(xiàn)為痛覺異常，即非傷害性刺激（如觸、壓、冷、熱）引起疼痛；痛覺過敏和自發(fā)性疼痛[3-4]。慢性痛非常頑固，嚴(yán)重干擾生活[5-6]，且目前缺乏有效的治療手段[7]，因此，預(yù)防慢性疼痛的發(fā)生尤其重要。盡管對疼痛的機(jī)制研究有30年以上歷史，但介導(dǎo)急性痛向慢性痛轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制仍缺乏共識[8]。血液免疫是對外周神經(jīng)損傷及病變的一道重要免疫防線，但慢性痛發(fā)生發(fā)展過程中循環(huán)血液免疫是否會發(fā)生變化，以及是否介導(dǎo)疼痛的慢性化過程還很不清楚。

趨化因子C-X-C基序配體12（CXCL12，又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/SDF-1）是一個新的神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子。CXL12及其受體均在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛相關(guān)結(jié)構(gòu)中有表達(dá)，并通過中樞和外周機(jī)制及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)機(jī)制參與病理性疼痛的發(fā)展和維持過程[9]。因而，CXCL12 通路可作為治療慢性疼痛的潛在靶點(diǎn)。本研究首先在小鼠保留性神經(jīng)損傷（spared nerve injury，SNI）的經(jīng)典慢性疼痛模型上觀察血漿CXCL12的時程性變化，再從正反兩個實(shí)驗(yàn)初步探討這一變化與疼痛慢性化的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料健康成年C57BL/6小鼠，7～10周，體質(zhì)量（25±5）g 97只，雌性對半，由中山大學(xué)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。這些動物被安置在12 h的光/暗循環(huán)（07：00 燈光開關(guān)），可隨意獲得食物和水。室溫保持在（23±1）℃，濕度保持在50%～60%。所有的動物實(shí)驗(yàn)程序都得到了中山大學(xué)動物倫理和使用委員會（IACUC）的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 SNI依照以前的文獻(xiàn)進(jìn)行SNI手術(shù)操作[10-11]。先將小鼠在2%異氟醚麻醉呼吸器下麻醉后，在左側(cè)大腿腘窩處中間作一縱行切口；辨認(rèn)清楚坐骨神經(jīng)及其三根分支（腓腸神經(jīng)、腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)），分離腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)并用5-0 縫線結(jié)扎；再在結(jié)扎遠(yuǎn)端剪斷0.2 mm的殘端，最后分層縫合肌肉和皮膚。手術(shù)過程忌觸碰或牽拉腓腸神經(jīng)。假手術(shù)組僅暴露腘窩處坐骨神經(jīng)三分支，不損傷神經(jīng)。待動物麻醉蘇醒后正常飼養(yǎng)。

1.2.2 機(jī)械痛閾測試采用Von-Frey 纖維絲對小鼠的左后肢足底小魚際肌處進(jìn)行垂直刺激，待其彎曲形成大S 形停止，刺激時間為4～6 s，若小鼠呈現(xiàn)縮足或舔足則為陽性反應(yīng)，若無則為陰性反應(yīng)。初始刺激力度設(shè)定0.4 g，單力度測5次，刺激間隔30 s，最大力度設(shè)定2.0 g。計(jì)算小鼠50%縮足反應(yīng)閾值即為機(jī)械撤足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）。在實(shí)驗(yàn)前后不同時間點(diǎn)進(jìn)行PWT 測定。其中SNI術(shù)前或靜脈注射CXCL12及其中和抗體前1～3 d的機(jī)械性縮足閾值均數(shù)記為小鼠初始PWT，靜脈注射后3～6 h后進(jìn)行雙側(cè)痛行為學(xué)測試。

1.2.3 血漿樣本收集選取假手術(shù)組撤足閾值無明顯變化，而SNI后雙側(cè)爪子撤足閾值明顯降低的不同組小鼠收集血漿進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測（圖1）。各組小鼠在2%異氟醚麻醉呼吸器下麻醉后仰臥固定，然后自胸部剪開劍突至鎖骨下的皮膚和胸壁，撕開心包，暴露心臟；再用1 mL 注射器針頭扎入右心房，抽吸0.5～0.6 mL回心血液放入4℃EDTA抗凝管中，然后以3 000 r/min 速度離心15 min 吸取上層血漿標(biāo)本于-80℃保存，用于后續(xù)細(xì)胞因子Western blot及Elisa檢測。

1.2.4 Western blot先取等量蛋白的血漿樣本，再加入loading buffer 混勻后加熱煮沸變性，接著取20 μL處理樣本上樣于12%SDS-PAGE 凝膠的樣本孔底進(jìn)行電泳分離，再濕轉(zhuǎn)入0.45 μm PVDF 膜上。經(jīng)5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后再在4℃環(huán)境下與兔單克隆抗體anti-CXCL12（1∶1 000、ab18919 Abcam）一抗輕搖孵育過夜。再與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔二抗抗體（1∶5 000，Abcam）孵育1 h后，用ECL（Millipore公司）化學(xué)發(fā)光液顯色，Tanon-5200 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon 科技公司）曝光，再經(jīng)CCD 攝像頭拍攝顯影條帶，ImageJ 對圖像進(jìn)行光密度分析。以假手術(shù)組的平均光密度為1 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其他組的數(shù)據(jù)則為假手術(shù)組的倍數(shù)。

1.2.5 血漿CXCL12 ELISA測定血漿CXCL12的表達(dá)水平采用小鼠CXCL12 ELISA試劑盒（ab100741，Abcam）測定。簡而言之，取50 μL 血漿樣本應(yīng)用于CXCL12 ELISA檢測，所有步驟依照產(chǎn)品說明書規(guī)范操作。最后經(jīng)450 nm 波長的酶標(biāo)儀測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.2.6 尾靜脈注射重組小鼠CXCL12先將重組小鼠CXCL12蛋白質(zhì)（P4371，Abnova）配置成100 μg/mL存儲液放在-80℃冰箱備用，給藥前再用0.1%BSA的生理鹽水中稀釋至工作濃度。為生物學(xué)仿生模擬小鼠SNI 9 d后血漿CXCL12 病理性濃度200 pg/mL（圖2D），成年小鼠（±25 g）的血漿容量約為1 mL，因此每只小鼠注射200 μL的1.0 ng/mL CXCL12 工作液，以在血漿中達(dá)到約200 pg/mL。此外，由于CXCL12的血半衰期＜30 min[20]，并且有其他多種血液細(xì)胞的影響，而且CXCL12 通過單核/巨噬細(xì)胞中的自分泌/旁分泌機(jī)制促進(jìn)自身生產(chǎn)[21]，同時還增加兩個較高劑量的CXCL12 注射組（2.5、5.0 ng/mL的CXCL12 工作液，分別對應(yīng)于500 pg/mL和1 000 pg/mL的血漿CXCL12 濃度）。給正常小鼠連續(xù)9 d 尾靜脈注射1.0 ng/mL CXCL12（200 μL，每天1次）。對照組為注射等量含0.1%BSA的無菌生理鹽水（vehi，圖3）。

1.2.7 尾靜脈注射CXCL12蛋白或CXCL12中和抗體根據(jù)ELISA 實(shí)驗(yàn)，SNI模型小鼠血漿CXCL12的病理濃度高達(dá)200 pg/mL（圖1D），再依照CXCL12中和抗體（ab9797，Abcam）產(chǎn)品說明書提示，抗體濃度為CXCL12的20～40倍時對CXCL12 生 物 活性產(chǎn)生半數(shù)最大抑制【ND50】。因此，采用抑制病理性CXCL12的合適CXCL12 中和抗體量為20 ng。在中和實(shí)驗(yàn)中，在注射外源性CXCL12或手術(shù)操作30 min 前并連續(xù)9 d（每天1次）通過尾靜脈注射200 μL 20 ng anti-CXCL12 抗體。對照組小鼠注射等量的無菌生理鹽水（vehi，圖4）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)（1）SNI術(shù)后血漿CXCL12濃度的時程變化：30只C57BL/6小鼠分為6組，雌性對半。其中空白對照（Contr）及SNI后1、3、9 d（SNI 1 d、SNI 3 d、SNI 9 d）各組5只，假手術(shù)3 d組（Sh3d/Sh）6只，SNI21d 4只。不同時間手術(shù)，同一時間取血分離血漿進(jìn)行后續(xù)WB和Elisa 實(shí)驗(yàn)。取材前進(jìn)行痛行為學(xué)測試。（2）靜脈注射外源性CXCL12 對正常小鼠機(jī)械痛閾的影響：35只C57BL/6小鼠分為4組。溶劑對照（Vehi，n=9）及不同濃度CXCL12 3組（1.0 ng/mL 8只，2.5 ng/mL 10只，和5.0 ng/mL 8只）早上八點(diǎn)靜脈注射一次200 μL，連續(xù)9 d。在注射前后不同時間點(diǎn)進(jìn)行機(jī)械痛閾測試。（3）靜脈注射CXCL12 中和抗體對CXCL12 與SNI誘導(dǎo)機(jī)械痛敏的影響：32只C57BL/6小鼠分為6組。除SNI組4只動物外，其他5組各5只：溶劑對照組（Vehi）、靜脈注射200 μL 2.5 ng/mL CXCL12組（2.5 ng/mL CXCL12）、靜脈注射200 μL 20 ng CXCL12 中和抗體組（anti-CXCL12）、靜脈注射CXCL12 中和抗體30 min后再靜脈注射CXCL12組（anti-CXCL12+CXCL12）、靜脈注射CXCL12 中和抗體30 min后再進(jìn)行SNI組（anti-CXCL12+SNI）。早上八點(diǎn)靜脈注射，持續(xù)9 d。在注射前后不同時間點(diǎn)進(jìn)行機(jī)械痛閾測試。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖1各組行為學(xué)的結(jié)果和圖2WB、Elisa 結(jié)果，采用的是單因素方差分析來比較不同組間的差異，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。圖3和4的機(jī)械痛閾的結(jié)果，采用的是雙因素方差分析來比較不同組間的差異，并用Turkey′s 法進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNI后血漿CXCL12持續(xù)增加大量的研究表明外周損傷孫受周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CXCL12明顯增加且廣泛參與病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程[12-13]。但外周神經(jīng)損傷后是否會影響血液CXCL12表達(dá)的變化還不是很清楚。因此，本研究首先觀察觀察外周神經(jīng)損傷SNI模型后血液免疫中CXCL12是否發(fā)生變化。與筆者前期研究一致[14]，SNI后同側(cè)后肢的機(jī)械痛閾明顯下降，對側(cè)也出現(xiàn)相同的變化趨勢，但與手術(shù)側(cè)無明顯差異（圖1）。在痛行為學(xué)測試基礎(chǔ)上提取SNI后不同時間點(diǎn)的血漿進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示SNI1d 血漿CXCL12 明顯升高，3 d 達(dá)到高峰，9 d 維持不變（圖2A、2B）。ELISA結(jié)果進(jìn)一步顯示，SNI后1～21 d 血漿CXCL12 水平逐漸升高，從假手術(shù)組（46.45±3.47）pg/mL 上升到（161.20±18.88）pg/mL（圖2C）。因此，SNI后血漿CXCL12 持續(xù)增多至少長達(dá)21 d，提示CXCL12 可能在疼痛的慢性化中起重要作用。

2.2 靜脈注射外源性CXCL12劑量依賴性引起機(jī)械痛覺過敏為了明確SNI后小鼠血漿CXCL12持續(xù)升高與疼痛的慢性化關(guān)聯(lián)，設(shè)計(jì)正反兩方面的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行研究。首先是在正常動物中補(bǔ)充病理濃度的CXCL12，觀察小鼠痛行為學(xué)的變化。由于CXCL12 半衰期很短（＜30 min）[15-16]，而Elisa結(jié)果顯示小鼠慢性痛條件下血漿CXCL12的病理性濃度大約為200 pg/mL，且持續(xù)增加21 d。首先采用尾靜脈注射不同劑量的外源性CXCL12（1.0、2.5、5.0 ng/mL，200 μL，每天1次，持續(xù)9 d）來模擬血漿CXCL12 病理濃度（200 pg/mL）的持續(xù)增加（圖3A）。痛行為學(xué)測試結(jié)果顯示（圖3B），與溶劑對照組相比（Vehi），靜脈注射1.0 ng/mL CXCL12在給藥5 d后才能顯著降低雙側(cè)機(jī)械痛閾；而2.5、5.0 ng/mL CXCL12 從第1次給藥后3 h 就能降低正常小鼠的機(jī)械痛閾，并隨給藥次數(shù)增加其作用越明顯。這表明血漿CXCL12 持續(xù)增加不僅是SNI 引起的血液免疫變化的結(jié)果，同時也是引起疼痛慢性化的重要原因。

2.3 中和CXCL12能緩解靜脈注射CXCL12與SNI引起的機(jī)械痛敏為明確血漿CXCL12增多是否為疼痛慢性化的必要條件，觀察中和血液CXCL12對靜脈注射CXCL12引起的機(jī)械痛敏影響，還有其對SNI誘導(dǎo)慢性痛的影響。在正常小鼠靜脈注射9 d CXCL12（2.5 ng/mL）或SNI模型上預(yù)防性給予20 ng 200 μL CXCL12 中和抗體（注射CXCL12 前30 min或SNI 前30 min及術(shù)后每天1次，持續(xù)9 d），然后通過機(jī)械測試觀察小鼠痛行為學(xué)變化情況（圖4A）。痛行為學(xué)結(jié)果顯示（圖4B），CXCL12中和抗體不影響假手術(shù)組小鼠的機(jī)械痛閾。CXCL12 中和抗體不僅能抑制靜脈注射2.5 ng/mL CXCL12 引起的雙側(cè)急性痛閾下降（6，2 h），也能抑制持續(xù)CXCL12 注射引起的慢性機(jī)械痛敏。此外，CXCL12中和抗體還能明顯緩解SNI 引起的機(jī)械痛敏。上述研究結(jié)果表明，表明血液中持續(xù)增加的CXCL12確實(shí)是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛慢性化的重要原因。

3 討論

慢性疼痛是一種疾病，其中神經(jīng)病理性疼痛是最嚴(yán)重的一類。各種神經(jīng)損傷如胸科等外科術(shù)后[17]神經(jīng)痛、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、多發(fā)性硬化、糖尿病外周神經(jīng)痛等疾病不僅引起劇烈、持續(xù)且毀滅性的疼痛，且與疾病最初反應(yīng)不成比例，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。因此，慢性痛的高發(fā)病率以及社會危害不言而喻。此外，神經(jīng)病理性疼痛的治療仍是臨床尚未解開的難題之一。

一般認(rèn)為，慢性痛的發(fā)病機(jī)制主要包括外周敏化和中樞敏化[18]。研究顯示外周神經(jīng)損傷通過神經(jīng)通路引起脊髓中樞敏化及膠質(zhì)細(xì)胞激活，激活的膠質(zhì)細(xì)胞通過合成和釋放多種致炎趨化因子也能影響中樞敏化介導(dǎo)疼痛的慢性化[11，18-20]。但單側(cè)外周神經(jīng)損傷不僅引起同側(cè)慢性痛，而且也會引起對側(cè)肢體相應(yīng)部位出現(xiàn)與患側(cè)肢體相同的持續(xù)性疼痛，即鏡像痛（mirrorpain）。SNI只在損傷側(cè)產(chǎn)生機(jī)械異位痛，而對側(cè)則沒有。但GRACE 等[21-23]和筆者[14]的研究表明，SNI 以及其他單側(cè)外周神經(jīng)損傷也可以在同性別同種屬動物中引起雙側(cè)痛覺過敏。此外，持續(xù)的慢性痛還會引起雙側(cè)海馬、前額葉皮質(zhì)等高位中樞神經(jīng)回路的功能和結(jié)構(gòu)重塑及神經(jīng)炎癥從而導(dǎo)致感知和行為的長期變化（記憶障礙和抑郁）等共病現(xiàn)象[24-25]。這一現(xiàn)象不僅在實(shí)驗(yàn)動物中得到證實(shí)[11-26]，而且也有臨床證據(jù)支持[27]。這些變化都不能僅僅從痛覺的神經(jīng)傳導(dǎo)通路來解釋，而可能與全身的血液免疫有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)SNI 確實(shí)可引起非結(jié)扎側(cè)的機(jī)械痛閾下降，即痛覺異常（圖1）。同時也觀察到SNI后血漿CXCL12 持續(xù)增加，這與筆者前期研究發(fā)現(xiàn)SNI后血漿TNF-α、IL-1β增加一致[24，26]，表明外周神經(jīng)損傷后血液免疫確實(shí)發(fā)生了變化。進(jìn)一步的研究顯示在正常動物靜脈被動注射外源CXCL12 模擬血液CXCL12 持續(xù)增加確實(shí)能引起雙側(cè)機(jī)械痛閾下降（圖3B）。而且，靜脈注射CXCL12的中和抗體不僅能緩解SNI 引起的同側(cè)機(jī)械痛敏，也能緩解非結(jié)扎側(cè)的痛覺異常（圖4B 右）。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)血液CXCL12增加是引起鏡像痛的必要條件。因此，這一結(jié)果有效地揭示了SNI 產(chǎn)生鏡像痛的機(jī)制，同時也進(jìn)一步證實(shí)外周神經(jīng)損傷引起的血液免疫的變化可能是引發(fā)雙側(cè)疼痛的重要誘因。

近年來多種慢性痛模型上的研究發(fā)現(xiàn)，CX-CL12表達(dá)不僅在痛覺通路的一級神經(jīng)元脊神經(jīng)節(jié)（DRG）中表達(dá)增加，而且脊髓及其以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞中也明顯增加；鞘內(nèi)注射CXCL12（250 ng）能引起持續(xù)3 d的機(jī)械痛敏和2 d的熱痛敏，CXCL12 中和抗體或阻斷CXCR4 受體通路都能減輕神經(jīng)病理性疼痛[28-29]。這些結(jié)果都表明CXCL12在病理性疼痛的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用，并且神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)機(jī)制也參與CXCL12/CXCR4 軸向介導(dǎo)的疼痛處理過程。本研究從外周循環(huán)免疫的全新角度來探查血漿CXCL12在神經(jīng)病理性疼痛動物模型上的變化及其意義。本研究發(fā)現(xiàn)血漿CXCL12水平從SNI后1 d 持續(xù)增加，持續(xù)至少21 d（圖2），這提示血漿中變化的CXCL12 可能與疼痛的慢性化密切相關(guān)。為了證實(shí)血漿CXCL12上升不僅僅是一種神經(jīng)炎癥的伴隨變化，還在急性疼向慢性疼轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用，本研究設(shè)計(jì)了正、反兩組實(shí)驗(yàn)。首先采用連續(xù)尾靜脈注射的辦法來觀察被動增加血漿CXCL12 對正常小鼠痛行為學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)靜脈注射病理濃度的CXCL12 確實(shí)會劑量依賴性引起雙側(cè)痛覺過敏（圖3）。接著通過靜脈注射CXCL12 中和抗體來阻斷CXCL12 作用后對已產(chǎn)生病理性疼痛動物痛行為學(xué)的影響。中和CXCL12不僅能抑制靜脈注射CXCL12 引起的慢性痛，而且也能緩解SNI 引起的機(jī)械痛敏（圖4）。這表明血液中持續(xù)增加的CXCL12 確實(shí)與鏡像痛的產(chǎn)生有關(guān)，并且與疼痛的慢性化有關(guān)。因而，抑制血液CXCL12增加或者阻斷CXCL12 通路能有效阻止疼痛慢性化。

圖1 用于收集血漿樣本的各組小鼠痛行為學(xué)測試結(jié)果Fig.1 Pain behavior test results of each group of mice used to collect plasma samples

圖2 SNI后血漿CXCL12 持續(xù)增加Fig.2 Continuous increase of plasma CXCL12 after SNI

圖3 靜脈注射不同濃度的外源性CXCL12 對正常小鼠機(jī)械痛閾的影響Fig.3 Effects of intravenous injection of exogenous CXCL12 at different concentrations on mechanical pain threshold in normal mice

圖4 靜脈注射CXCL12 中和抗體對CXCL12 與SNI 引起機(jī)械痛敏的影響Fig.4 Effects of CXCL12 neutralizing antibody on mechanical pain sensitivity induced by CXCL12 and SNI in intravenous injection

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)損傷后血漿CXCL12 持續(xù)增加，并從正反兩個角度證實(shí)血漿CXCL12 持續(xù)增加是急性痛轉(zhuǎn)化為慢性神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵。本研究首次從血液免疫角度揭示血漿CXCL12 持續(xù)增加為疼痛慢性化的充分必要條件，為急性痛轉(zhuǎn)化為慢性痛的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為開發(fā)鎮(zhèn)痛新藥提供新靶點(diǎn)和依據(jù)。同時本研究也初步證實(shí)了循環(huán)免疫在慢性病理性疼痛中的重要作用。接下來可結(jié)合臨床慢性神經(jīng)病理性疼痛等多種慢性痛患者血液免疫的變化來進(jìn)一步探討血漿CXCL12增多的臨床共性以及臨床意義；同時血漿CXCL12增多及其導(dǎo)致疼痛的慢性化的具體機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。