冬棗漿胞病菌的有效拮抗酵母篩選①

吳芳梅梅明鑫

(1海南省食品檢驗檢測中心(海南省試驗動物中心)海南?？?71100;2昌江黎族自治縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)檢驗檢測預警防控中心海南昌江572700)

沾化冬棗是棗屬（Zizyphus JujubeMill.）植物果實，富含氨基酸和多種維生素，具有較高的食用價值和保健功效［1］，因其皮薄、肉脆、汁多、口感好、營養(yǎng)豐富而倍受消費者喜愛。但是，沾化冬棗成熟期晚（10月中上旬成熟），常溫下很不耐貯藏，果實采收5～10 d以后就會失去鮮脆狀態(tài)，出現(xiàn)嚴重的皺縮、失水、酒軟和霉爛，還會伴有維生素的大量損失，導致冬棗供應期短，銷售面窄，一直以來都處于小范圍發(fā)展狀態(tài)。因此，做好冬棗的采后保鮮、延長鮮果供應期、提高采后效益尤為重要。

冬棗果實采后病害多數(shù)是潛伏性侵染病害，在采摘或貯藏過程中由于機械損傷及自身衰老過程的加劇，給了病原微生物可乘之機。因此，要減少采后病害引起的腐爛，需要在采后采取各種措施來抑制病原菌生長。目前冬棗采后病害防治主要有減壓貯藏、低溫貯藏、氣調(diào)貯藏、熱水處理等物理防治方法；此外還有采用保鮮劑、熏蒸和化學殺菌劑等化學防治，以及利用生防菌、植物源防腐保鮮劑等生物防治方法［2］。

利用拮抗微生物替代傳統(tǒng)化學殺菌劑來控制果蔬采后病害已經(jīng)成為研究的熱點。目前，已經(jīng)有研究表明，可以作為果蔬采后病害生防拮抗菌的微生物有細菌、霉菌和酵母菌等。其中，酵母菌營養(yǎng)要求低、拮抗效果好，一般不產(chǎn)生毒素、不會對公眾的健康及生態(tài)環(huán)境造成危害［3］，且酵母菌的遺傳學基礎研究比較清楚，具有通過基因工程技術(shù)改造來提高防病能力的潛力，一般不會產(chǎn)生對人體和寄主有害的代謝產(chǎn)物；對多種脅迫條件和逆境具有較強的耐受力，對多數(shù)化學殺菌劑不敏感，能夠與多種化學物質(zhì)及物理方法結(jié)合使用，并且酵母細胞本身含有豐富的營養(yǎng)物，許多酵母菌被廣泛應用于食品加工及釀造工業(yè)，已成為果蔬采后病害生物防治研究的主要菌種［4］。

本研究以冬棗漿孢腐爛病菌蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過離體篩選幾種水果表面拮抗酵母，并利用拮抗酵母對采后新鮮冬棗進行處理［5］，貯藏一段時間后檢測其對冬棗的保鮮效果；通過檢測冬棗的失重率、腐爛率、可溶性固形物、酸含量、VC含量等指標來評價其作用效果［6］，以期為冬棗的貯藏保鮮提供新途徑和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌株分離樣品

豐水梨、水蜜桃、葡萄及四川泡菜水購自雅安蒼坪路農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 冬棗

沾化冬棗購買于吉選超市，挑選大小一致、單果重20 g左右、無機械傷、無病蟲害、成熟度一致的冬棗。冬棗先用自來水清洗2遍，然后自然晾干，備用。

1.1.3 指示菌

蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。

1.1.4 培養(yǎng)基

（1）BDA培養(yǎng)基將200.0 g黃豆芽放入1.0 L的蒸餾水中煮沸30 min后，濾出黃豆芽；稱取20.0 g葡萄糖、17.0 g瓊脂加入到濾液中，加熱待瓊脂溶化，補水至1.0 L，用0.5 mol/L NaOH溶液或5%HCl（V/V）調(diào)節(jié)pH為6.8。

（2）BD培養(yǎng)液除了不加瓊脂外，配置方法同BDA。

（3）PDA培養(yǎng)基［4］馬鈴薯先洗凈去皮，再稱取200 g，切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用紗布過濾，再加入葡萄糖20.0 g、瓊脂17.0 g、蒸餾水1.0 L，調(diào)節(jié)pH至6.8。

（4）KBA培養(yǎng)基K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、甘油10.0 g、蛋白胨20.0 g、瓊脂200 g、蒸餾水1.0 L，pH調(diào)至6.8。

（5）KB培養(yǎng)液除了不加瓊脂外，配置方法同KBA。

以上培養(yǎng)基均在121℃下高壓蒸汽滅菌25 min，備用。BDA用于酵母菌的分離，KBA用于酵母菌平板篩選，酵母菌的純化與保存用PDA。

1.2 方法

1.2.1 拮抗酵母的分離與篩選

1.2.1.1 拮抗酵母的分離

用水果刀切取10.0 g的果實樣品，將其切碎，放入裝有90 mL BD培養(yǎng)液的三角瓶中，然后加入3滴乳酸，置于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)（26℃，200 r/min）30 min；用無菌移液管吸取富集菌體的濾液1 mL，加入至裝有9 mL無菌生理鹽水（0.85%）的試管中，即稀釋為10倍，編號為1號；混勻后，從1號試管中吸取1 mL菌懸液加入另一個裝有9 mL無菌生理鹽水（0.85%）的試管中，即為10-2，編號為2，同法稀釋成10-3，10-4，10-5，10-6倍濃度樣品稀釋液；吸取不同濃度梯度稀釋液100滋L注入90 mm BDA平板，用滅菌涂布器涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d；取出平板，鏡檢形態(tài)整齊、大小均勻、菌態(tài)飽滿的單菌落菌體，確定為酵母菌后，反復純化后PDA斜面4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€稀釋度重復3個平板［7］。

1.2.1.2 拮抗酵母的篩選

用移液管吸取l×108cfu/mL酵母菌懸液1 mL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；待酵母菌在培養(yǎng)基表面長成一層較厚的菌苔，用7 mm內(nèi)徑的無菌打孔器打孔，制備酵母菌苔瓊脂塊［8］。將指示菌分別制成菌懸液備用；將裝有l(wèi)00 mL PDA固體培養(yǎng)基的三角瓶加熱融化，置于55℃的水浴鍋中保溫，取l mL指示菌菌懸液加入培養(yǎng)基中，搖勻，迅速倒入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固；將分離出的酵母菌制成酵母菌苔，挑取酵母菌苔，正面朝上放置于混菌培養(yǎng)基上，每個平板均勻放置4個酵母菌苔，于28℃培養(yǎng)24 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并用十字交叉法測定抑菌圈直徑，實驗重復3次。

1.2.1.3 拮抗酵母菌的復篩

方法同1.2.1.2，篩選出最適拮抗酵母菌。

1.2.2 拮抗酵母發(fā)酵液處理冬棗的貯藏保鮮效果

1.2.2.1 冬棗的處理

將所篩選的最適拮抗酵母菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中，置28℃、200 r／min搖床培養(yǎng)24 h，用血球計數(shù)板制成l×108CFU/mL菌懸液。試驗共設5個不同處理［9］，分別為CK、BAY、AYB1、AYB2、AYB3，每 處 理2次 平行，每小組40個果實。（1）對照組（CK）：冬棗以無菌水浸泡1 min，自然晾干，再浸泡蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液1 min。（2）自身對照組（BAY）：先浸泡蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液，自然晾干后再浸泡108CFU/mL酵母發(fā)酵液。（3）AY處理組：分別用106CFU/mL（AYB1）、107CFU/mL（AYB2）、108CFU/mL（AYB3）的酵母發(fā)酵液浸泡1 min，自然晾干，各浸泡蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液1 min。每處理20個冬棗，2次重復。處理完畢后，自然晾干，將處理組與對照組的冬棗分別封入聚乙烯保鮮袋中編號，于（4±1）℃貯藏［10］。每隔5 d觀察一次，統(tǒng)計冬棗果實腐爛情況，隨機挑選8個果實，測定各項貯藏品質(zhì)指標。

1.2.2.2 相關(guān)指標測定

腐爛率計算公式：腐爛率＝腐爛果實數(shù)/處理的果實總數(shù)×100%；失重率采用稱重法。

果肉硬度采用硬度計測定（由于冬棗果實比較小，為了比較硬度的變化，規(guī)定每次進入硬度計8 mm即可，測得果實硬度為相對硬度［11］）；可溶性固形物含量采用手持糖度儀測定；可滴定酸含量用酸堿滴定法（以檸檬酸計［12］），按照GB/T 12456-2008測定；維生素C含量的采用紫外快速測定法。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進行統(tǒng)計與分析，差異顯著性分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母的篩選結(jié)果

經(jīng)過初步分離純化，共獲得6株抑菌作用明顯的酵母菌株。由表1可知，S24對指示菌的抑菌效果最好，對蠟狀芽孢桿菌的抑菌圈直徑為18.9 mm，對枯草芽胞桿菌的抑菌圈直徑達20.3 mm，比其他的酵母菌的抑菌圈都要大。

表1拮抗酵母菌株對病原菌的抑菌圈直徑 單位：mm

由圖1可知，S24對枯草芽胞桿菌的抑制效果最為明顯，對蠟樣芽胞桿菌也有較好的抑菌效果。因此，將此株菌用于冬棗的貯藏實驗最為合適。

2.2 菌種的鑒定結(jié)果

挑取單菌落，利用顯微鏡鏡臺測微尺和目鏡測微尺進行觀察測量，確定S24為酵母菌株，形狀為球形或橢球形，酵母菌直徑為3.86～6.46滋m（圖2）。

圖1 S24對蠟樣芽胞桿菌（a）和枯草芽胞桿菌（b）的抑菌效果

圖2 S24單菌落（a）和顯微（40×）（b）照片

2.3 拮抗酵母S24對貯藏冬棗保鮮效果

2.3.1 對冬棗可滴定酸含量的影響

由圖3可知，冬棗在貯藏過程中，可滴定酸含量的變化均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。經(jīng)過拮抗酵母S24處理的AYB3、AYB2、AYB1，可滴定酸含量變化不明顯，在貯藏25 d時，AYB3、AYB2、AYB1可滴定酸含量分別為2.53、2.38、2.49 g/kg，BAY可滴定酸含量為2.07 g/kg，處理組與對照組差異顯著（p＜0.05）。說明拮抗酵母抑制了冬棗果實內(nèi)部物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，可以延緩果實衰老，與李青云等［6］的研究結(jié)果一致。

2.3.2 對冬棗VC含量的影響

有研究表明，VC可以作為衡量鮮棗凍藏保鮮效果的生理指標［13］。由圖4可知，VC含量在冬棗果實貯藏過程中呈現(xiàn)出下降的趨勢，在BAY組及CK組貯藏前期急劇下降，而拮抗酵母S24處理的3組呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的下降趨勢；在貯藏25 d時，經(jīng)過拮抗酵母處理的AYB3、AYB2、AYB1與自身對照組BAY、空白對照組CK的VC含量差異顯著（p＜0.05）。說明拮抗酵母菌能在一定程度上保持冬棗的營養(yǎng)，與李青云［14］的研究結(jié)果一致。

2.3.3 拮抗酵母S24對貯藏冬棗硬度的影響

果實的衰老往往伴隨著果肉質(zhì)地變軟、硬度下降，甚至出現(xiàn)腐爛變質(zhì)。硬度可作為判定果實成熟以及衰老程度的指標［15］。由圖5可以看出，拮抗酵母S24對維持貯藏期間冬棗的硬度有較為明顯的效果，貯藏至25 d時，AYB3的硬度為13.50 kg/cm2，明顯高于CK與BAY組，差異顯著（p＜0.05）。

2.3.4 對冬棗可溶性固形物的影響

冬棗的可溶性糖含量很高，是其重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是呈現(xiàn)冬棗口感的重要因子。由圖6可以看出，經(jīng)過拮抗酵母S24處理后，冬棗可溶性固形物含量的代謝速率減緩，延遲了高峰期的到來。由此可見，拮抗酵母S24能夠抑制冬棗可溶性固形物的代謝速率。

圖3拮抗酵母S24對冬棗可滴定酸含量的影響

圖4拮抗酵母S24對冬棗中VC含量的影響

圖5拮抗酵母S24對冬棗硬度的影響

2.3.5 對冬棗失重率及其自然腐爛率的影響

圖6拮抗酵母S24對冬棗可溶性固形物含量的影響

冬棗貯藏期由于受環(huán)境及自身攜帶微生物侵染而導致腐敗變質(zhì)，這直接影響冬棗的商品貨架期。由表2可知，冬棗貯藏25 d后，拮抗酵母S24處理組的腐爛率顯著低于BAY組與CK對照組（p＜0.05）；此外，拮抗酵母S24處理組還能夠顯著降低冬棗的失重率，有助于保持冬棗的貯藏品質(zhì)。因此，選用拮抗酵母作為冬棗采后病害生物防治菌種是可行的。

表2拮抗酵母S24對貯藏25 d冬棗的失重率及其自然腐爛率的影響

3 討論與結(jié)論

近些年來，酵母菌應用于果蔬采后病害的生物防治越來越受到人們的重視［16-17］。與其他生防微生物相比，酵母菌作為果蔬生物防治拮抗菌最大的優(yōu)點是能夠在較干燥的果蔬表面生存，并且能夠迅速繁殖，受殺蟲劑的影響也較小［18］。對于果蔬采后拮抗酵母菌的分離方法，大多數(shù)研究者還是傾向于從果蔬表面直接分離，一方面拮抗酵母一般對人、畜無毒害［19-20］，另一方面能夠適應果蔬表面的微生態(tài)環(huán)境。本次實驗僅從抑菌效果、小批量冬棗貯藏保鮮效果方面篩選出適用于冬棗采后病害生物防治的酵母菌，而未探究拮抗酵母菌的增殖培養(yǎng)條件及生化特性等。

離體篩選試驗結(jié)果顯示，拮抗酵母菌（S24）的抑菌效果最佳。從貯藏期間果實內(nèi)含物質(zhì)含量的變化情況可知，該拮抗酵母能有效抑制冬棗在低溫貯藏條件下的自然腐爛，并較好地保持冬棗貯藏期間的相關(guān)品質(zhì)指標值。因此，該株酵母菌適用于冬棗采后腐爛病害的生物防治。