豇豆鏈格孢葉斑病病原菌鑒定①

張 龍 范詠梅

(1樂(lè)東黎族自治縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 海南樂(lè)東572500;2海南大學(xué) 海南?？?70100)

豇豆是海南省重要的冬季瓜菜和經(jīng)濟(jì)作物，海南市縣，如三亞市、樂(lè)東縣、陵水縣等廣泛種植，并形成了豇豆種植產(chǎn)業(yè)帶。2015年初，在海南省樂(lè)東縣黃流鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)一種疑似鏈格孢屬病原菌引起的葉斑?。?］，該病原菌宿主范圍廣，危害嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，該類病害對(duì)多種農(nóng)作物都會(huì)造成比較嚴(yán)重的損失，比較典型的病害有番茄早疫病和十字花科黑斑病［2］，主要集中在茄科、葫蘆科、十字花科和百合科等，是一種重要的作物病害，但關(guān)于其對(duì)豇豆的危害的研究較少，僅見(jiàn)Berg等［3］探討Alternaria對(duì)豇豆葉片的侵染率和6種殺菌劑對(duì)鏈格孢菌的毒害［4］。由于該類病原菌在其他經(jīng)濟(jì)作物上造成的危害較大，豇豆作為海南省扶貧產(chǎn)業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)作物，需要加強(qiáng)該病原菌對(duì)豇豆危害的研究，為農(nóng)民開(kāi)展田間防治提供科學(xué)依據(jù)。為了明確豇豆葉斑病的致病菌，在田間發(fā)病情況調(diào)查基礎(chǔ)上，采用柯赫氏法則（Koch’s Rule），從病害樣本中分離純化病原物，通過(guò)該病原菌的形態(tài)特征及其分子鑒定結(jié)果來(lái)確定病原菌種類。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株為室內(nèi)培養(yǎng)的‘豐產(chǎn)六號(hào)’豆角，購(gòu)買于海南省?？谑旋埲A潮汕種子店。供試菌株（z1）從海南省樂(lè)東縣黃流鎮(zhèn)病葉樣品中分離純化獲得。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，Po‐tato Dextrose Agar）（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來(lái)水1 000 mL，自然pH）。

試劑和儀器：Fungal DNA Kit（50）真菌DNA小量提取試劑盒（北京索萊寶公司），凝膠提取試劑盒Gel Extraction Kit（100）（北京索萊寶公司），引物（華大合成），PMD18-T（大連TAKARA公司），全自動(dòng)高壓滅菌鍋（Hipayama Manufacturing Corpora‐tion made in JAPAN），恒溫生化培養(yǎng)箱（上海南榮公司），數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋（雙列）（常州國(guó)華電器公司），顯微鏡（Nikon Corporation Tokyo，Japan），電泳儀（北京市六一儀器廠），紫外儀（北京市六一儀器廠），PCR儀（北京百泰克公司）等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定

在無(wú)菌條件下，參照毛細(xì)管打孔單胞分離法［5］和絲孢綱真菌單胞分離法［6］對(duì)病原菌進(jìn)行分離，將培養(yǎng)后的病原菌進(jìn)行純化，并用試管在4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫@得的菌株（命名為zl菌株）；將純化后的單孢菌株接于PDA平板中央，于28℃恒溫、明暗交替條件下培養(yǎng)7 d；用涂布稀釋法制成孢子懸浮液，于顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，測(cè)量分生孢子的長(zhǎng)度和寬度；根據(jù)玻片標(biāo)本法在顯微鏡下觀察分生孢子、分生莖和喙的形態(tài)，并觀察成鏈情況［7］。

1.2.2 病原菌致病性的測(cè)定［8］

用75%酒精消毒豇豆活體植株葉片，并用無(wú)菌水洗滌，套袋保濕一天；將單孢分離獲得的菌株在水瓊脂中28℃培養(yǎng)7 d后，制成孢子懸浮液，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，直接噴灑在豇豆活體植株葉片上；接種植株病癥重復(fù)顯現(xiàn)后，統(tǒng)計(jì)記錄發(fā)病葉片數(shù)，計(jì)算發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的分子鑒定

用真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA；采用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1和ITS4，以25滋L的體系對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用Blast將所測(cè)得的序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，獲得相似性最高的序列，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定病原菌菌種。PCR反應(yīng)體系：TaqMix 12滋L，10 mmol/L Primer（forward）1滋L，10 mmol/L Primer（reverse）1滋L，基因組DNA 1滋L，ddH2O 10滋L。目的基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸55 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃停止。

反應(yīng)完成后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物；用膠回收試劑盒法回收（OMEGA公司Gel Extraction Kit（100）回 收目 的片 段，在16℃下連接克隆載體PMD18-T，利用大腸桿菌的感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克?。焕脫u菌法鑒定，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，PCR反應(yīng)體系為TaqMix 10滋L，Primer（forward）0.5滋L，Primer（reverse）0.5滋L，ddH2O 9滋L，引物為M13通用引物；選取陽(yáng)性克隆子送去華大基因進(jìn)行測(cè)序；利用Blast將所測(cè)得的序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，獲得與每條序列相似性最高的序列，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定病原菌菌種。

2 結(jié)果與分析

2.1 豇豆葉斑病田間癥狀

經(jīng)調(diào)查，該病菌主要危害豇豆葉片，田間單株葉片發(fā)病率約為3%，發(fā)病初期產(chǎn)生豌豆大小灰色或者淺褐色圓形（圖1），病斑中央灰白色，逐漸擴(kuò)大后呈灰色，葉緣部分枯萎。早期，病灶表面出現(xiàn)輪狀，大小為2～5 mm；晚期病變?yōu)楹稚?，擴(kuò)大至25 mm，在嚴(yán)重的情況下，可導(dǎo)致葉萎蔫和壞死。

圖1豇豆葉斑病田間癥狀

2.2 豇豆葉斑病病原菌的致病性

回接并套袋保濕7 d后，病癥重復(fù)顯現(xiàn)（圖2），發(fā)病率為65%。從感染豇豆葉片中分離到菌落生長(zhǎng)和孢子形態(tài)相同的病原菌［9］，符合柯赫氏法則。因此可以確定此菌株為豇豆葉斑病的致病菌。

2.3 豇豆葉斑病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將單孢菌株接于PDA平板中央，于28℃恒溫、明暗交替條件下培養(yǎng)7 d，菌絲生長(zhǎng)良好，呈放射狀生長(zhǎng)，氣生菌絲灰白色。在初始菌絲萌發(fā)后，它以圓形的形式擴(kuò)散至培養(yǎng)基中；形成圓形后，菌絲邊緣仍呈白色，中間色澤逐漸變暗，呈棕黑色，菌絲生長(zhǎng)較快。分生孢子花梗直立或彎曲，通常不分枝，隔膜，淺橄欖棕色，2～7滋m寬；分生孢子是頂生和單生，或形成3～8孢子的中等長(zhǎng)鏈，長(zhǎng)橢圓形和棒狀，有橫膈膜3～8個(gè)，縱膈膜0～6個(gè)，（9～55）滋m×（7～15）滋m（不包括喙），有喙（圖3）。因此，將其初步鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternata）［10］。

圖3病原菌形態(tài)

2.4 豇豆葉斑病病原菌的分子生物學(xué)鑒定［11］

凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，提取的DNA樣品可用于靶帶的PCR擴(kuò)增。將純化后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得片段約為600 bp（圖4），經(jīng)純化后測(cè)序，獲得樣品序列大小為571 bp。NCBI在線Blast比對(duì)結(jié)果顯示，所得樣品序列與NCBI登錄號(hào)為AY154699.1與BNCBI登錄號(hào)為AY154698.1的鏈格孢霉序列相似度很高，達(dá)99%。通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的交叉比對(duì)，并用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析其同源關(guān)系。該序列的28S rDNA片段序列和ITS rDNA片段序列表明該病原體的基因序列與鏈格孢屬（Alternaria）同源性大于99%（圖5），表明zl菌株與鏈格孢遺傳距離最小，歸為一類。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，確定豇豆葉斑病病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alter‐nata）。

圖4病原菌DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖5 zl菌株ITS系列同源性比較結(jié)果

3 討論

豇豆鏈格孢葉斑病主要危害豇豆葉片，發(fā)病初期產(chǎn)生豌豆大小灰色或者淺褐色圓形，病斑中央灰白色，逐漸擴(kuò)大呈灰色，葉緣部分枯萎。早期，病灶表面出現(xiàn)輪狀，大小為2～5 mm；晚期病變?yōu)楹稚?，擴(kuò)大至25 mm，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致葉萎蔫和壞死。鏈格孢屬（Alternaria）屬半知菌類，絲孢綱，絲孢目，又稱交鏈孢屬；分生孢子梗淡褐色至褐色，彎或屈曲，孔生式產(chǎn)孢，合軸式延伸或不延伸，孢痕明顯；分生孢子串生或單生，淡褐色至深褐色，卵圓形或倒棍棒形，具縱橫隔膜，表面光滑或有疵，頂端常具喙?fàn)罴?xì)胞，常呈分支或不分支的孢子鏈［12］，是最常見(jiàn)、最復(fù)雜的真菌之一。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)針對(duì)由鏈孢霉引起的許多病害［13］進(jìn)行了詳細(xì)的報(bào)道，如新疆棗果黑斑?。?4］、南瓜葉枯?。?5］、番茄早疫病［16］、大白菜黑斑?。?7］、玉米鏈格孢葉斑病、葡萄鏈格孢葉斑?。?8］等。鄭肖蘭等［19］對(duì)玉米鏈格孢葉斑病研究表明，該病主要危害玉米葉片和苞葉，初期病部出現(xiàn)水漬狀小圓斑點(diǎn)，中央灰白色至純白色，邊緣紅褐色，病健部交界明顯；后期整株葉片發(fā)病嚴(yán)重直至葉片死亡，與豇豆鏈格孢葉斑病發(fā)生癥狀相似。豇豆作為海南省重要扶貧產(chǎn)業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)作物，為防患于未然，需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)這一病害的生物學(xué)特性研究及田間藥劑篩選，為農(nóng)戶今后的田間防治提供科學(xué)有效的依據(jù)。