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    秋水仙素對(duì)菊苣多倍體的誘導(dǎo)

    2020-09-24 03:14:59趙建華任國輝鄭金雙
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年16期
    關(guān)鍵詞:秋水仙素菊苣誘導(dǎo)

    趙建華 任國輝 鄭金雙

    摘要:利用不同質(zhì)量濃度秋水仙素溶液對(duì)菊苣生長點(diǎn)進(jìn)行不同次數(shù)的誘變處理。通過觀察氣孔特征、測(cè)定DNA相對(duì)含量進(jìn)行誘變植株篩選鑒定,確定其倍性水平。結(jié)果表明,0.2%秋水仙素處理4次,菊苣誘導(dǎo)率最高,為8.16%,獲得8株菊苣同源四倍體植株,與二倍體對(duì)照相比,變異植株葉片增厚,葉色加深,葉片褶皺,下表皮氣孔變大,保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量增加,葉綠素含量增加,單位面積氣孔數(shù)目減少。本試驗(yàn)共獲得23株變異植株,其中22株同源四倍體,1株混倍體,構(gòu)建了菊苣多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系,獲得了菊苣多倍體新種質(zhì),豐富了菊苣遺傳基礎(chǔ),為良種選育提供了材料。

    關(guān)鍵詞:菊苣;秋水仙素;誘導(dǎo);同源四倍體

    中圖分類號(hào):S567.23+9.035.2

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)16-0177-06

    菊苣(Cichorium intybus L.)為菊科菊苣屬多年生草本植物,營養(yǎng)價(jià)值高,抗逆性強(qiáng)。以干燥地上部分及根入藥,味微苦、咸,具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等功效[1]。菊苣葉片柔嫩多汁,營養(yǎng)物質(zhì)豐富,研究表明,其葉叢期含粗蛋白22.87%,初花期含粗蛋白14.73%、粗脂肪2.1%、粗纖維30.6%,被稱為綠色健康之王[2]。目前,國內(nèi)關(guān)于菊苣的研究多集中于栽培技術(shù)[3-4]、活性成分測(cè)定及提取物的藥理作用[5-6]等方面,而對(duì)于菊苣遺傳育種方面的研究較少,張玉等利用60CO-r輻照菊苣種子發(fā)現(xiàn),高劑量輻照對(duì)菊苣誘變效果明顯[7],但誘變是正向還是逆向則需進(jìn)一步在農(nóng)藝性狀方面作深入研究。

    多倍體植物大多表現(xiàn)為營養(yǎng)器官的“巨大性”,具有生長健壯、抗逆性增強(qiáng)、果實(shí)增大以及營養(yǎng)物質(zhì)含量提高等優(yōu)點(diǎn),因此多倍體誘變育種已成為植物育種的重要方式,目前已在大田作物、蔬菜作物、觀賞植物、藥用植物育種方面得到廣泛應(yīng)用。隗志松等研究發(fā)現(xiàn),多倍體水稻植株高大粗壯,穗大粒大,稻米質(zhì)優(yōu),抗逆性強(qiáng)[8]。茆吉健利用秋水仙素誘變處理獲得四倍體蘿卜,產(chǎn)量較二倍體增加26.92%,并且根內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖等營養(yǎng)成分較二倍體植株顯著增加[9]。宋蓮等利用秋水仙素對(duì)墨蘭×大花蕙蘭的F1進(jìn)行誘變處理,獲得的多倍體植株觀賞價(jià)值高和抗逆性強(qiáng)[10]。王鳳寶等采用秋水仙素浸泡枸杞干種子,獲得了對(duì)癭螨免疫,高抗白粉病和根腐病,營養(yǎng)品質(zhì)和藥用成分(甜菜堿、枸杞多糖、黃酮類)顯著高于二倍體對(duì)照的多倍體新種質(zhì)[11]。

    本試驗(yàn)采用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素溶液對(duì)子葉期菊苣進(jìn)行不同次數(shù)的誘變處理,以期構(gòu)建菊苣多倍體誘導(dǎo)技術(shù)新體系,豐富菊苣種質(zhì)資源。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    菊苣(Cichorium intybus L.)種子,購于承德興春和農(nóng)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    本試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),2因素(不同秋水仙素濃度)3水平(不同處理次數(shù))處理。

    第1次誘變處理于2017年10月初進(jìn)行。將菊苣種子直播于50孔育苗穴盤中,置于棚中育苗,待菊苣2張子葉完全展開后,將棉球置于兩子葉中間的生長點(diǎn)處,利用不同質(zhì)量濃度秋水仙素(0.05%、0.10%、0.20%)分別于06:00—07:00和17:00—18:00處理3、5、7次。以蒸餾水處理為對(duì)照,每個(gè)處理50株,2次重復(fù),待所有處理結(jié)束后,摘去棉球,繼續(xù)育苗。

    第2次誘變處理于2018年3月中旬,第3次于10月初在智能日光溫室中進(jìn)行試驗(yàn)。處理方法同第1次處理,利用0.1%和0.2%秋水仙素溶液分別處理不同次數(shù)(4、6、8次),每個(gè)處理50株,3次重復(fù)。

    1.3 多倍體植株的篩選與鑒定

    1.3.1 氣孔鑒定 當(dāng)植株有完全展開的3張葉時(shí),取二倍體和誘變植株完全展開的葉片,用鑷子撕取下表皮,置于滴有1滴蒸餾水的載玻片上,蓋片,趕出氣泡,吸去多余水,于Olympus BX53光學(xué)顯微鏡下觀察,20×鏡下選取10個(gè)視野,觀察氣孔大小、單位面積氣孔數(shù)目并記錄,篩選氣孔變異的植株為候選植株。

    氣孔變異植株比例=氣孔鑒定變異株數(shù)/處理株數(shù)×100%。

    1.3.2 DNA相對(duì)含量鑒定 利用流式細(xì)胞儀鑒定氣孔以獲得候選植株進(jìn)行NDA相對(duì)含量鑒定,剪取二倍體和誘變植株完全展開的幼嫩葉片,放入裝有500 μL裂解液的預(yù)冷培養(yǎng)皿中,刀片快速切碎,用260~560目的尼龍網(wǎng)過濾到離心管中,放置于冰中 5 min,加入100 μL PI染色液,于冰上避光染色 12 min,染色后移至上樣管中,利用BD LSR FortessaTM流式細(xì)胞儀檢測(cè),確定其倍性水平,并對(duì)獲得的變異植株編號(hào),T表示同源四倍體(T-1至 T-22),H表示混倍體(H-1)。

    根據(jù)秋水仙素處理后成活株數(shù)計(jì)算致死率,依據(jù)上述鑒定方法獲得的變異株數(shù)計(jì)算誘導(dǎo)率。

    致死率=死亡株數(shù)/處理幼苗總數(shù)×100%;

    誘導(dǎo)率=變異株數(shù)/處理幼苗總數(shù)×100%

    1.4 二倍體與變異植株的比較

    1.4.1 葉片大小及厚度的測(cè)量 在植株有5張完全展開葉時(shí),取二倍體與變異植株的完全展開葉,用直尺測(cè)量葉長和葉寬,再利用打孔器取中葉脈兩側(cè)的葉片,用游標(biāo)卡尺測(cè)量10張小葉片的厚度。

    1.4.2 氣孔大小的比較 取二倍體和變異植株完全展開的葉片,利用氣孔鑒定的制片方法,在顯微鏡下觀察,40×鏡下選取5個(gè)視野,測(cè)量氣孔的長和寬,記錄氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目。

    1.4.3 葉綠素含量測(cè)定 稱取0.2 g成熟葉片放入研缽中,加入95%乙醇研成勻漿,移至10 mL容量瓶中定容,3 000 r/min離心5 min,取上清液,加95%乙醇稀釋,利用分光光度計(jì)于662、644 nm下比色,記錄吸光度D值并計(jì)算葉綠素含量。

    葉綠素含量(mg/L)=5.13×D662 nm+20.44×D644 nm;葉綠素相對(duì)含量(mg/g)=葉綠素濃度(mg/L)×葉綠素溶液體積(mL)/葉片質(zhì)量(g)×1 000。

    2.5 數(shù)據(jù)分析

    利用Excel表格和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 秋水仙素誘導(dǎo)條件篩選

    由表1可知,在第1次誘變中,植株變異率最高為31.00%(0.20%秋水仙素處理7次),最低為13.00%(0.05%秋水仙素處理3次)。由于棚中高溫低濕的條件不利于幼苗生長,導(dǎo)致幼苗死亡率極高,隨著秋水仙素濃度的增加,致死率逐漸升高,0.20%秋水仙素處理7次致死率最高,為100%,0.05%秋水仙素處理3次致死率最低,為87.00%。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),0.05%秋水仙素處理生長點(diǎn)后植株形態(tài)變異數(shù)量最少;不同質(zhì)量濃度處理3次時(shí),植株形態(tài)變異數(shù)量均少于其他處理次數(shù)。因此,秋水仙素濃度為0.05%,處理次數(shù)為3次時(shí),均不適合作為秋水仙素誘導(dǎo)菊苣多倍體的處理?xiàng)l件。

    與第1次誘變處理相比發(fā)現(xiàn),第2次誘變處理的植株形態(tài)變異的株數(shù)較多,變異率增加。形態(tài)鑒定結(jié)果表明,0.20%秋水仙素處理8次,變異率最高,為49.67%,0.10%秋水仙素處理4次,變異率最低,為35.33%。0.20%秋水仙素處理6次、8次致死率最高,均為31.67%;0.10%秋水仙素處理4次致死率最低,為13.67%。DNA相對(duì)含量鑒定共獲得16株變異植株,誘導(dǎo)率最高為5.33%(0.20%秋水仙素處理4次),誘導(dǎo)率最低為1.67%(0.10%秋水仙素處理6次、0.20%秋水仙素處理8次)。移栽至智能日光溫室后,高溫低濕的條件導(dǎo)致病蟲害發(fā)生嚴(yán)重,變異植株死亡率極高。

    3.2 秋水仙素對(duì)菊苣誘變效果的影響

    由表2可知,不同質(zhì)量濃度的秋水仙素和不同次數(shù)處理之間相比較,隨著濃度和處理次數(shù)的增加,誘導(dǎo)率和致死率均呈增加趨勢(shì)。氣孔鑒定的結(jié)果表明,0.2%秋水仙素處理4次和6次變異率較高,分別為8.00%和6.67%,與其他處理相比差異顯著。0.1%秋水仙素處理6次致死率最低,為1.00%;0.2%秋水仙素處理8次致死率最高,為10.26%。DNA相對(duì)含量鑒定結(jié)果表明,0.2%秋水仙素處理4次和6次誘導(dǎo)率較高,分別為8.16%(8株)和7.14%(7株),與其他處理相比差異顯著;0.1%秋水仙素處理4次誘導(dǎo)率最低,為0.99%(1株)。

    利用流式細(xì)胞儀對(duì)不同倍性的菊苣進(jìn)行鑒定(圖1),橫軸為熒光強(qiáng)度值,縱坐標(biāo)為細(xì)胞核數(shù)量,不同倍性菊苣的熒光強(qiáng)度峰值不同。二倍體熒光強(qiáng)度值為50時(shí),細(xì)胞核數(shù)量達(dá)到最大值;四倍體熒光強(qiáng)度值為100時(shí),細(xì)胞核數(shù)量達(dá)到最大值;混倍體在熒光強(qiáng)度值為50和100時(shí),均出現(xiàn)峰值。

    3.3 二倍體與多倍體菊苣的比較

    3.3.1 葉片特征、氣孔特征及葉綠素含量比較 變異植株的葉色加深,葉片褶皺(圖2-A);四倍體氣孔增大,單位面積氣孔數(shù)目減少,混倍體氣孔大小不一(圖2-B、圖2-C、圖2-D)。由表3可知,變異植株的葉長和葉寬均顯著低于二倍體植株。所有四倍體植株的葉厚均大于二倍體植株,其中 T-1、T-2、T-5、T-6、T-7、T-13、T-19、T-20和H-1與對(duì)照相比差異不顯著。所有變異植株的葉綠素含量均顯著高于二倍體植株,不同變異植株間葉綠素含量差異較大,其中T-6、T-7、T-10、T-12、T-16和 H-1葉綠素含量較高。

    3.3.2 菊苣氣孔大小、單位面積氣孔數(shù)目及葉綠體數(shù)目的比較 由表4可知,變異植株(除F5、H-1)的氣孔長度顯著大于二倍體植株,其中T-5與二倍體差異不顯著;變異植株氣孔寬度均小于二倍體植株,其中T-22與二倍體差異不顯著。變異植株葉片下表皮單位面積氣孔數(shù)目與二倍體相比減少19.78%~88.39%,與二倍體植株存在顯著差異。四倍體植株葉片下表皮保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目顯著的多于二倍體植株,增加了12.05%~32.53%,但混倍體植株與二倍體植株差異不顯著。

    變異植株之間單位面積氣孔數(shù)目差異不顯著,其中T-10、T-14、T-17、T-18、T-20、T-21和H-1的單位面積氣孔數(shù)目;T-2和T-3單位面積氣孔數(shù)目較多。

    4 結(jié)論與討論

    秋水仙素是人工誘導(dǎo)植物多倍體常用的藥劑,在細(xì)胞有絲分裂期間通過抑制紡錘體的形成從而實(shí)現(xiàn)染色體的數(shù)目加倍[12-13],但高濃度的秋水仙素可以致使材料的生長受到抑制或死亡。殷婷婷利用不同濃度秋水仙素和通過不同處理時(shí)間以誘導(dǎo)油菜種子,發(fā)現(xiàn)0.4%秋水仙素處理48 h時(shí)死亡率最高為63%[14]。彭綠春等利用不同濃度秋水仙素和不同時(shí)間浸泡腋花杜鵑無菌苗,發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度為0.25%處理72 h死亡率最高為60%[15]。孫嘉曼等采用不同濃度秋水仙素對(duì)野生蕉愈傷組織進(jìn)行不同時(shí)間誘變處理,以0.2%濃度處理15 d時(shí)致死率最高,為43.62%[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度越高,處理次數(shù)越多,幼苗致死率越高,其中0.2%秋水仙素處理8次時(shí),致死率最高,為10.26%。

    篩選最佳的秋水仙素濃度和處理時(shí)間,是獲得多倍體植物的關(guān)鍵因素??拙S一等采用秋水仙素處理一串紅幼苗莖尖,發(fā)現(xiàn)0.1%秋水仙素處理2 d時(shí)誘變率最高,為13.3%[17]。吳照云等利用秋水仙素處理胭脂蘿卜幼苗生長點(diǎn),表明以2 g/L秋水仙素誘變率最大,為33.3%[18]。鄧云等采用秋水仙素處理二倍體不結(jié)球白菜,表明以0.1 mol/L秋水仙素處理6次效果最好,誘導(dǎo)率達(dá)17.5%[19]。本研究以不同質(zhì)量濃度秋水仙素處理不同次數(shù)來誘導(dǎo)菊苣幼苗生長點(diǎn),結(jié)果表明,0.2%秋水仙素處理4次菊苣誘變效果最好,誘導(dǎo)率為8.16%。

    同源四倍體植株葉片厚度、氣孔大小、葉綠素含量、保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)均高于二倍體植株,而氣孔密度低于二倍體植株[20]。漆慧娟比較不同倍性的甜葉菊發(fā)現(xiàn),四倍體植株氣孔密度比二倍體減少49.16%,保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)較二倍體增多78.49%,氣孔長和寬比二倍體分別增加72.25%和69.25%,葉綠素含量也顯著高于二倍體[21]。鐘程等比較不同倍性水平貴州野生淡黃花百合,發(fā)現(xiàn)四倍體植株氣孔比二倍體明顯增大,單位面積氣孔數(shù)目減少,且氣孔長寬及單位面積氣孔數(shù)均達(dá)到極顯著水平[22]。吳順等比較不同倍性水平的紫花丹參,發(fā)現(xiàn)多倍體葉綠素含量比二倍體提高近75%[23]。本研究中,菊苣變異植株葉片下表皮單位面積氣孔數(shù)較二倍體減少11.61%~55.22%,葉綠素含量比二倍體提高近23.46%,四倍體保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)較二倍體增加84.56%,葉片厚度及氣孔大小均與二倍體存在顯著差異。

    本試驗(yàn)得到的變異植株,其葉長和葉寬顯著低于二倍體,其原因可能是秋水仙素的毒害作用,使菊苣F1植株生長緩慢,葉片褶皺,葉面積減小,若收獲四倍體植株的種子后繼續(xù)種植,其葉面積可能增大。

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