基于激光共聚焦顯微技術(shù)鑒別小麥矮腥黑穗病菌和光腥黑穗病菌

劉儉儉 張建民 陳萬權(quán) 劉太國 高利

摘要：由小麥矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn）引起的小麥矮腥黑穗病和由小麥光腥黑穗病菌[Tilletia foetida （Walle.） Lindr]引起的小麥光腥黑穗病都是世界性的病害，小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害，是麥類黑穗病中危害最大、極難防治的檢疫性病害之一，小麥光星黑穗病在我國被列為北京市的檢疫對象。采用激光共聚焦顯微技術(shù)結(jié)合染色方法可簡便快速區(qū)分小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌，2種病原菌的冬孢子壁分別呈綠色網(wǎng)紋熒光及均勻平滑綠色熒光，檢測可在5～7 min完成，為快速區(qū)分2種病原菌的冬孢子提供了一種新的方法。

關(guān)鍵詞：小麥矮腥黑穗病菌;小麥光腥黑穗病菌;激光共聚焦顯微技術(shù);檢測方法

中圖分類號：S435.121.4+4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0126-04

由小麥矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn）引起的小麥矮腥黑穗病是重要的檢疫性病害，病原菌冬孢子可在土壤中存活10年之久，一旦發(fā)病，很難防治[1-2]。由小麥光腥黑穗病菌[T. foetida （Walle.） Lindr]引起的小麥光腥黑穗病是一種全球性的麥類黑穗病，被我國劃為北京市的檢疫對象[3]，該病原菌冬孢子在土壤中可存活2年以上，室內(nèi)干燥情況下可存活20年之久。2種病原菌的冬孢子在形態(tài)學(xué)上很相似[4]，小麥矮腥黑穗病菌在1935年被Young首次鑒定，被認(rèn)為是光腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌（T. caries）之間的變種，隨后被作為一個新物種發(fā)表[5]。國內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及分子生物學(xué)方面進(jìn)行了大量研究工作。小麥矮腥黑穗病菌冬孢子直徑為14～22 μm，光腥黑穗病菌冬孢子直徑為19～24 μm[6]，小麥矮腥黑穗病菌冬孢子形態(tài)上網(wǎng)脊較高，孢壁外由1層透明的膠質(zhì)鞘包圍，而光腥黑穗病菌冬孢子光滑無網(wǎng)脊。小麥矮腥黑穗病菌的冬孢子在5 ℃光照條件下約30 d可萌發(fā)，而小麥光腥黑穗病菌的冬孢子在15 ℃條件下約需7 d可萌發(fā)[4，7]。根據(jù)冬孢子自發(fā)熒光的特性[8]，蔚慧欣等發(fā)現(xiàn)，激光共聚焦顯微鏡下可區(qū)分2種病原菌的冬孢子[9]。此外，研究者們還嘗試了SCAR（特定序列擴(kuò)增）、RM-PCR（DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性引物介導(dǎo)的不對稱復(fù)性溫度PCR）、Rep-PCR（基因組短重復(fù)序列PCR）以及ISSR（簡單重復(fù)序列間區(qū)）等分子檢測方法[10-14]。

激光共聚焦顯微技術(shù)是以普通熒光顯微鏡為基礎(chǔ)，添加激光發(fā)射和掃描裝置、計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)等，通過光學(xué)斷層掃描待觀察樣品，利用三維結(jié)構(gòu)重建等得到熒光圖像的一種現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡[15]，與普通顯微鏡相比，共聚焦和點掃面技術(shù)使圖像的分辨率和準(zhǔn)確率顯著提高，其通過光線來完成對標(biāo)本的切片，而不是使用傳統(tǒng)機(jī)械方式，這種方法對標(biāo)本沒有損傷[16]。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)具有細(xì)胞生物學(xué)功能、圖像處理功能，激光共聚焦顯微技術(shù)目前在細(xì)胞生物學(xué)[17]、植物學(xué)[18]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。另外，從谷物的胚中分離出的高度保守的麥胚凝集素（WGA）是一種植物凝集素，可特異性識別與結(jié)合真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)[19]，WGA與綠色熒光基團(tuán)Alexa Fluor 488連接具有很好的熒光標(biāo)記作用。目前，激光掃描共聚焦顯微鏡顯微技術(shù)結(jié)合染色技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物體內(nèi)病原真菌，如玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis），禾草離蠕孢（Bipolaris sorokiniana）和印度梨形孢（Piriformospora indica）[20-22]的檢測，其主要優(yōu)點是可以在細(xì)胞內(nèi)看到標(biāo)本的三維圖像[23]。Gao等曾利用激光共聚焦顯微鏡觀察玉米瘤黑粉菌在玉米花藥中的侵染過程[20]。蔚慧欣等曾利用此方法觀察小麥矮腥黑穗病菌在小麥體內(nèi)的侵染過程[24]。本研究應(yīng)用激光共聚焦顯微掃描術(shù)，實現(xiàn)了不分離病原菌的冬孢子，直接在小麥病粒內(nèi)部快速檢測和區(qū)分小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試種子和病原菌 供試小麥種子為東選3號，小麥矮腥黑穗病菌來自美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院（United States Department of Agriculture，Agricultural Research Service），小麥光腥黑穗病菌源自河南。本試驗于2019年5—9月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑和儀器 Alexa Flour 488（AF488）標(biāo)記的麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）購自北京冰達(dá)生物科技有限公司，無水乙醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，pH值為7.4）購自北京廣達(dá)恒益科技有限公司。

激光共聚焦顯微系統(tǒng)采用高性能的Leica TCS SP8，整個系統(tǒng)主要由1臺倒置熒光相差顯微鏡、1組由半導(dǎo)體激光器、氬離子氣體激光器、氦氖離子氣體激光器組成的多波長激光器以及1臺控制系統(tǒng)運行的工作站構(gòu)成[25]。

1.2 方法

1.2.1 小麥的種植 小麥種子用30%次氯酸鈉表面消毒5 min后用滅菌蒸餾水沖洗3次，放入5 ℃培養(yǎng)箱中春化1個月，直到胚芽鞘長至1～3 cm。將春化好的種子播種于直徑20 cm的花盆中，深度3 cm左右，每盆種10株，置于溫度為5～10 ℃，24 h全光照的培養(yǎng)箱（LT-36VL，Percival，USA）中生長。拔節(jié)期后調(diào)節(jié)溫度為15～20 ℃。

1.2.2 接種的菌懸液制備 用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡（Laica S6D，德國）下調(diào)整小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子濃度均為1×106個/mL，200 μL/皿將其涂布于2%土壤培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基上，分別置于4、16 ℃和相對濕度50%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至冬孢子萌發(fā)，以菌絲長到冬孢子直徑的1/2時視為萌發(fā)，約70%的冬孢子萌發(fā)后用滅菌蒸餾水將菌絲沖洗下來，用紫外分光光度計（TU-1900，China）測得菌絲懸液D600 nm值為0.1～0.2備用。

1.2.3 接種小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌 待小麥苗長到孕穗期即穗子發(fā)育至小麥旗葉全部從倒2葉葉鞘內(nèi)伸出時用注射器將備用菌絲懸液注射入小麥旗葉與幼穗之間的空腔1 mL，接種頻率1次/d，連續(xù)接種5 d。

1.2.4 樣品染色 待小麥長至抽穗期采集病粒，將其放于無水乙醇中，取病粒加無菌水清洗3遍，用鑷子將病粒壓碎并離心（12 000 r/min，1 min），去上清。將待測樣品置于20～30 μg/mL WGA-AF488染料中染色40～60 min，然后用1×PBS（pH值7.4）沖洗3～5次，并保存在1×PBS中待觀察。所有操作均在室溫下進(jìn)行，染色后的樣品要避光保存。

1.2.5 鏡檢觀察 將染色后的含小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的病粒（小麥籽粒）染液放在凹玻片上，置于20倍激光共聚焦顯微鏡下觀察，選用激發(fā)波長488 nm進(jìn)行光學(xué)切片逐層掃描。

1.2.6 分析圖像 根據(jù)掃描的圖像，分析熒光在2種冬孢子表面成像的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌冬孢子的熒光成像

以488 nm的波長激發(fā)光對冬孢子進(jìn)行光學(xué)掃描，可分別在波長為510～570、590～680 nm范圍內(nèi)得到相應(yīng)發(fā)射光。小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌冬孢子均可被WGA-AF488染成綠色（圖1）。

2.2 小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌冬孢子的掃描圖片

對染色后的小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌2種冬孢子進(jìn)行層切掃描，各自獲得15張不同層面的連續(xù)光學(xué)切片掃描圖像（圖2、圖3）。在2種冬孢子中，都能在488 nm的激發(fā)波下看到綠色熒光形態(tài)清楚，同時在明場下可觀察到不同層面的清晰結(jié)構(gòu)。層切掃描顯示綠色熒光在這2種冬孢子的空間分布存在明顯差異：小麥矮腥黑穗病菌冬孢子的網(wǎng)脊和細(xì)胞壁均被染色，光圈直徑（22.99±0.29） μm，而小麥光腥黑穗病菌冬孢子顯示較為平滑的綠色熒光，光圈直徑（16.37±0.33） μm。

3 討論與討論

激光共聚焦顯微技術(shù)以其成像清晰、精確、客觀等特點在生物學(xué)研究方面廣為應(yīng)用[26]。本試驗通過激光共聚焦顯微鏡來觀察WGA-AF 488染色后的小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌冬孢子，其結(jié)果相對基于自發(fā)熒光區(qū)分的激光共聚焦檢測方法[8]更為穩(wěn)定與準(zhǔn)確，該方法可在5～7 min內(nèi)得到檢測結(jié)果，為小麥矮腥黑穗病菌和光腥黑穗病菌的快速檢測與鑒定提供了快速、準(zhǔn)確的方法。

在本研究中使用了幾丁質(zhì)特異性染料WGA-AF488，它與真菌病原體相互作用并釋放綠色熒光圖像。結(jié)果表明，小麥矮腥黑穗病菌冬孢子呈現(xiàn)網(wǎng)紋的綠色，而小麥光腥黑穗病菌冬孢子細(xì)胞壁呈現(xiàn)平滑均勻的綠色，進(jìn)而根據(jù)這一特征成功區(qū)分2種病原菌的冬孢子（圖2、圖3）。

基于2種病原菌冬孢子的形態(tài)特征，普通光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡可用于區(qū)分2種病原菌的冬孢子[4]，基于自發(fā)熒光特點，可采用激光共聚焦顯微技術(shù)區(qū)分2種病原菌的冬孢子[9]，但是以上的檢測方法均要基于分離出大量冬孢子樣本才可以進(jìn)行檢測，且冬孢子的自發(fā)熒光有強(qiáng)有弱，遇到自發(fā)熒光比較弱的時候就很難將二者區(qū)分開來。而本研究是用發(fā)病的植物組織（小麥籽粒）直接染色病菌冬孢子并進(jìn)行層掃檢測，可觀察到植物組織（小麥籽粒）中肉眼看不到的少量冬孢子，進(jìn)而實現(xiàn)病原菌的快速檢測，本方法可為其他類似植物體內(nèi)病原菌的檢測提供可借鑒的思路及方法。

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