TNZS基生物材料的體外組織相容性

趙倩

TNZS基生物材料的體外組織相容性

趙倩

(江蘇大學(xué) 京江學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

以Ti，Nb，Zr，Sn，Cu，Ag，Co等單質(zhì)粉末為原料，采用高能球磨?模壓成形?真空燒結(jié)工藝制備Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn合金(簡(jiǎn)稱(chēng)TNZS合金)，以及分別含有5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Cu，Ag和Co的TNZS基合金(TNZS-5Cu，TNZS-5Ag 和TNZS-5Co合金)。在含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基中接種SD大鼠成骨細(xì)胞，在合金表面進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞貼附和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：在TNZS材料中分別添加5%的Cu，Ag和Co均能在一定程度上提高成骨細(xì)胞的增殖能力。在培育初期(24 h和72 h)，TNZS-5Co合金表面最有利于促進(jìn)細(xì)胞貼附；而在培育后期(120 h和168 h)，TNZS-5Cu和TNZS-5Ag合金表面更有利于成骨細(xì)胞的貼附。TNZS-5Ag合金表面貼附的成骨細(xì)胞形貌和伸展度最好，其次是TNZS-5Co，而TNZS和TNZS-5Cu合金表面的細(xì)胞貼附能力相對(duì)較弱。4種TNZS基材料的細(xì)胞毒性等級(jí)均為2級(jí)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)定，均符合生物醫(yī)用植入體材料的細(xì)胞毒性要求。

TNZS合金；生物材料；粉末冶金；組織；性能

Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn(縮寫(xiě)為T(mén)NZS)合金是楊銳 等[1?2]采用熔鑄法制備的一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的β型鈦合金。該合金的最大優(yōu)勢(shì)在于擁有超低的彈性模量(42.1 GPa)[3]，在眾多鈦合金中，它與人體骨骼的彈性模量最接近[4]。此外，TNZS合金還具有良好的力學(xué)性能、阻尼性能以及超彈性等，是目前公認(rèn)的最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镝t(yī)用材料之一[5?6]，但其生物相容性還無(wú)法完全滿(mǎn)足臨床醫(yī)學(xué)使用的要求。Cu具有較好的韌性和延展性，耐磨損，抗腐蝕，生物相容性?xún)?yōu)良，同時(shí)還能提高合金材料的燒結(jié)性能；Ag不但具備良好的延展性和生物相容性，還具有較好的耐磨損性能；Co的硬度高，延展性好，耐磨損，耐腐蝕，且具有良好的抗氧化性能。研究表明，在醫(yī)用鈦合金中添加適量的Cu，Ag和Co，可以在保證基本力學(xué)性能的前提下?lián)碛袕V譜殺菌的功效，有利于解決鈦合金外科植入體的細(xì)菌感染問(wèn)題[7?8]。因此，在TNZS合金中添加Cu，Ag，Co等元素，有望解決TNZS合金在臨床醫(yī)學(xué)使用中的韌性、耐磨性、生物相容性等的協(xié)同效應(yīng)問(wèn)題，進(jìn)一步提高生物材料的綜合性能。采用粉末冶金法能直接生產(chǎn)所需形狀和尺寸的零部件，從而減少后續(xù)的機(jī)械加工，降低生產(chǎn)成本；并且在真空燒結(jié)過(guò)程中不會(huì)給材料帶來(lái)污染，從而最大限度地降低材料的雜質(zhì)含量；此外還能確保材料成分配比的正確性和組織均勻性[9?10]，在制備鈦合金生物醫(yī)用材料中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本文作者以Ti，Nb，Zr，Sn，Cu，Ag，Co等單質(zhì)粉末為原料，采用高能球磨?模壓成 形?真空燒結(jié)工藝制備TNZS合金，以及分別含有5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Cu，Ag和Co的TNZS基生物材料(TNZS-5Cu，TNZS-5Ag和TNZS- 5Co合金)，并進(jìn)行大鼠成骨細(xì)胞的增殖、細(xì)胞貼附和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，研究Cu，Ag和Co的添加對(duì)TNZS基合金體外組織相容性的改善效果，并闡述其作用機(jī)制，以期為T(mén)NZS基合金的發(fā)展及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 TNZS基合金的制備

實(shí)驗(yàn)用原料粉末為T(mén)i，Nb，Zr，Sn，Cu，Ag，Co單質(zhì)粉末，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)，分析純。表1所列為T(mén)NZS基合金的編號(hào)與原料配比。首先按照表1稱(chēng)量原料粉末，放入Al2O3球磨罐中，加入直徑為8 mm的瑪瑙球，球料質(zhì)量比為10:1，將球磨罐安裝在QM-3SP4型行星式球磨機(jī)上，以400 r/min的轉(zhuǎn)速球磨72 h。球磨后的粉料真空干燥4 h，然后裝入直徑為30 mm的模具中，在YB32-100型液壓機(jī)上以18 MPa的壓力壓制成形，保壓3 min。成形坯體在120 ℃下真空干燥10 h后，在WZS-20型雙室真空燒結(jié)爐中進(jìn)行真空無(wú)壓燒結(jié)：抽真空至1×10?1Pa，升溫速率為10 ℃/min，燒結(jié)工藝為600 ℃/2 h ?800 ℃/ 2 h?1 000 ℃/2 h?1 250 ℃/2 h，隨爐冷卻，得到TNZS合金(Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn)以及TNZS- 5Cu，TNZS-5Ag和TNZS-5Co等4種TNZS基合金樣品。用線(xiàn)切割機(jī)將TNZS基合金切成尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的試樣，打磨、拋光，作為測(cè)試用樣品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

首先在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中接種SD大鼠成骨細(xì)胞，然后將其放入恒溫孵育箱中于37 ℃、飽和濕度、5%CO2條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。48 h后換培養(yǎng)液，此后每3天換液一次，直至細(xì)胞數(shù)量達(dá)85%時(shí)，棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再采用0.25%胰酶和0.02%EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，化學(xué)式C10H16N2O8)按1:1體積比混合的混合液消化3~5 min，立即加培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打瓶底進(jìn)行細(xì)胞脫壁處理以形成懸液，然后利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并加培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，取懸液備用[11]。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.3.1 前期準(zhǔn)備

將尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的TNZS基合金試樣依次用丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水超聲清洗10 min，然后121 ℃高壓滅菌20 min。將合金試樣按0.5 mL/cm2置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫37 ℃浸提72 h，用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾浸提液以達(dá)到除菌效果，于4 ℃溫度下恒溫避光保存培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)設(shè)TNZS，TNZS-5Cu，TNZS-5Ag，TNZS-5Co合金和空白組以及陰性和陽(yáng)性對(duì)照組，共7組，每組設(shè)4個(gè)孔。通過(guò)各孔向DMEM培養(yǎng)液內(nèi)滴入0.2 mL1.2節(jié)制備的SD大鼠成骨細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL的懸液，24 h后換培養(yǎng)液，此后每隔24 h換液一次。分別在培育24，72，120，168 h后，向各孔內(nèi)注入10 μL用PBS為溶劑配制的質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT(四唑鹽，化學(xué)式C18H17N5S)溶液，再培育4 h，使其充分還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在活性細(xì)胞中，離心處理后，吸棄各孔的上清液，加0.1 mL的DMSO(二甲基亞砜)以溶解細(xì)胞中的甲瓚，振蕩10 min。然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的490 nm 波長(zhǎng)的OD(optical density，吸光度)[12]，測(cè)量3次，計(jì)算平均值，再用式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率CPIR(cell proliferation inhibition rate)。

1.4 細(xì)胞貼附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞貼附實(shí)驗(yàn)前期的準(zhǔn)備工作同細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。向放有28孔待測(cè)TNZS基合金的培養(yǎng)板內(nèi)分別滴入0.2 mL含有SD大鼠成骨細(xì)胞的懸液，于恒溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2濃度條件下培育7 天。去除培養(yǎng)液，加入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛將細(xì)胞固定，加入無(wú)水乙醇梯度脫水后，轉(zhuǎn)入臨界點(diǎn)干燥儀的樣品室內(nèi)，利用液態(tài)CO2置換乙醇，再升溫加壓使CO2達(dá)到臨界狀態(tài)，4min后緩慢排出CO2，試樣干燥后，用MSP-1S噴金處理，用SEM掃描電鏡觀(guān)察成骨細(xì)胞于TNZS基合金表面的貼附形態(tài)。

1.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)前期的準(zhǔn)備工作與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相同。向TNZS基合金所在孔加入0.2 mL含有SD大鼠成骨細(xì)胞的懸液，陰性對(duì)照孔加0.2 mL高密度聚乙烯保鮮袋浸提的RPM1-1640培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照孔加0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的DMSO，空白對(duì)照孔加0.2 mL含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。在恒溫37 ℃、5%CO2濃度下培育72 h，然后向28孔內(nèi)各注入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液10 μL再培育4 h。吸棄浸提液的上清液，加0.1 mL的DMSO，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的490 nm波長(zhǎng)的OD。利用式(2)計(jì)算成骨細(xì)胞的相對(duì)增值率RGR(relative growth rate)，根據(jù)表2[12]進(jìn)行評(píng)級(jí)，評(píng)定TNZS基合金的細(xì)胞毒性程度。

細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖檢測(cè)均采用常規(guī)方法，采用間接培養(yǎng)(MTT法)主要是為了便于毒性檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組的目的是驗(yàn)證相應(yīng)試驗(yàn)系統(tǒng)的反應(yīng)，設(shè)置陰性對(duì)照組是為了驗(yàn)證背景反應(yīng)。

表2 相對(duì)增值率(RGR)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞增殖

通過(guò)MTT比色法測(cè)得的吸光度(OD)可用來(lái)判斷TNZS基合金表面活細(xì)胞的數(shù)量，OD越小，細(xì)胞活性越弱，反之則細(xì)胞活性越強(qiáng)。表3所列為SD大鼠成骨細(xì)胞于TNZS，TNZS-5Cu，TNZS-5Ag和TNZS-5Co合金，以及陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組中分別培養(yǎng)24，72，120和168 h的OD平均值。從表中看出，接種于TNZS-5Co合金表面的成骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h和72 h的OD分別為0.202和0.264，高于相同培養(yǎng)時(shí)間的TNZS，TNZS-5Cu以及TNZS-5Ag合金表面的OD。這表明培養(yǎng)24 h及72 h時(shí)，TNZS-5Co合金表面的細(xì)胞活性最強(qiáng)，貼附的活性成骨細(xì)胞數(shù)量最多。培養(yǎng)120 h時(shí)，TNZS-5Cu合金的OD均為0.516，明顯高于其他3種合金，而培養(yǎng)168 h時(shí)，則是TNZS-5Ag合金的OD最高為0.544。這說(shuō)明隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，材料表面成骨細(xì)胞的增殖速率發(fā)生改變，且不同材料表面的細(xì)胞增殖速率差異較大。隨培養(yǎng)時(shí)間不斷延長(zhǎng)，TNZS合金的OD雖保持一定的增長(zhǎng)，但一直都是4組合金中最低的，這說(shuō)明TNZS-5Cu，TNZS-5Ag和TNZS-5Co合金的細(xì)胞增殖速率均高于TNZS合金的。在培育初期(24 h和72 h時(shí))，TNZS-5Co合金表面最有利于細(xì)胞貼附；而在培育后期(120 h和168 h時(shí))，則是TNZS-5Cu和TNZS- 5Ag表面更有利于成骨細(xì)胞的貼附。陽(yáng)性對(duì)照組的OD在培養(yǎng)前期隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)略有下降，而在培養(yǎng)后期基本保持不變，說(shuō)明延長(zhǎng)培育時(shí)間會(huì)抑制成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表3 TNZS基生物材料表面成骨細(xì)胞的OD均值

表4所列為T(mén)NZS基合金和對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率CPIR。CPIR越低，表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。從表5看出，培養(yǎng)72，120和168 h時(shí)，TNZS-5Cu，TNZS-5Ag和TNZS-5Co合金表面的細(xì)胞增值抑制率CPIR均低于TNZS合金的。表3和表4的結(jié)果都表明在TNZS合金中添加5%的Cu，Ag和Co均能在一定程度上促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，提高成骨細(xì)胞分泌、合成和礦化骨基質(zhì)的效率，從而加快人體新骨的形成。

表4 成骨細(xì)胞于TNZS基生物材料表面的增殖抑制率(CPIR)

2.2 細(xì)胞貼附

圖1所示為成骨細(xì)胞在TNZS基生物材料表面貼附168 h后的SEM形貌。從圖中看出，材料表面的成骨細(xì)胞形狀大小各異。由圖1可知，TNZS合金表面的成骨細(xì)胞主要呈橢球狀，表面細(xì)胞突起較少，形態(tài)較圓鈍，且偽足伸展不充分；TNZS-5Cu表面的成骨細(xì)胞擁有少量絲狀突起，偽足擴(kuò)散并且向四周延伸；TNZS-5Ag表面的成骨細(xì)胞主要呈梭狀，同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞依靠自身細(xì)長(zhǎng)的偽足牢牢攀附于合金表面，且具有分裂增長(zhǎng)的趨勢(shì)；TNZS-5Co表面的成骨細(xì)胞主要呈菱狀，細(xì)胞表面出現(xiàn)微絨毛和少量白色突起，同時(shí)可見(jiàn)部分偽足向四周伸展，且具有向孔穴內(nèi)部遷移的趨勢(shì)。一般認(rèn)為，表面粗糙、孔隙度高、親水性好的材料更有益于成骨細(xì)胞貼附[13]。測(cè)得TNZS及TNZS- 5Cu，TNZS-5Ag 和TNZS-5Co 4種TNZS基生物材料的表面粗糙度分別為0.513 6，0.158 3，0.337 2和 0.280 7 μm，孔隙度分別為9.93%，5.31%，7.70%和5.80%[14]，4種材料中TNZS-5Ag表面所貼附成骨細(xì)胞的形貌和伸展性最好，主要是因?yàn)槠浔砻娲植诙萢和孔隙率較高，且孔隙聚集現(xiàn)象明顯[14]，使得部分孔隙之間形成連通孔，為細(xì)胞向材料內(nèi)部遷移和生長(zhǎng)提供了良好的渠道，從而有益于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在孔隙間輸送，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，氧氣進(jìn)入以及代謝產(chǎn)物排出。此外Ag還能與空氣中的氧反應(yīng)獲得羥基自由基(—OH)，提高材料表面的親水性，從而使其具備良好的細(xì)胞貼附能力。TNZS合金的表面粗糙度和孔隙率均高于其他3種合金，但其細(xì)胞貼附能力卻相對(duì)較差，這可能與其孔隙大而分散[14]以及材料表面的親水性差有關(guān)。此外，與TNZS-5Cu相比，由于TNZS-5Co的表面粗糙度和孔隙度更高，所以TNZS-5Co表面的細(xì)胞貼附狀況優(yōu)于TNZS-5Cu。綜上所述，雖然4種TNZS基材料表面成骨細(xì)胞的形貌不同，但細(xì)胞的偽足生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說(shuō)明成骨細(xì)胞可以在這4種材料表面分裂、增殖。

圖1 成骨細(xì)胞貼附于TNZS基材料表面的SEM形貌

(a) TNZS; (b) TNZS-5Cu; (c) TNZS-5Ag; (d) TNZS-5Co

2.3 細(xì)胞毒性

表5所列為成骨細(xì)胞于4種TNZS基材料以及對(duì)照組中培育72 h的OD、相對(duì)增值率(RGR)和細(xì)胞毒性等級(jí)。從表中看出，4種材料的OD與陰性對(duì)照組(0.418 7)相比都有差別，TNZS-5Co的OD最大，為0.339 7，而TNZS的OD最小，為0.255 0。TNZS，TNZS-5Cu，TNZS-5Ag和TNZS-5Co的RGR分別為54.57%，55.85%，69.48%和72.69%。陽(yáng)性對(duì)照組的RGR明顯高于其他6組，從表2可知其細(xì)胞毒性等級(jí)為4級(jí)，不合格，具有細(xì)胞毒性，而陰性對(duì)照組的細(xì)胞毒性等級(jí)為1級(jí)，合格，無(wú)細(xì)胞毒性，說(shuō)明本研究可以準(zhǔn)確評(píng)判各試樣的細(xì)胞毒性等級(jí)。由表5可知，4種TNZS基生物植入體材料的細(xì)胞毒性等級(jí)均為2級(jí)，需結(jié)合細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)定。根據(jù)圖1(c)和(d)可知，成骨細(xì)胞在TNZS-5Ag和TNZS-5Co表面的偽足伸展充分，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，且二者的RGR相對(duì)較高，分別為69.48%和72.69%，因此可判定材料合格，無(wú)細(xì)胞毒性；而從圖1(a)和(b)看出TNZS和TNZS-5Cu表面的成骨細(xì)胞偽足相對(duì)較少，且RGR較低，分別為54.57%和55.85%，但這2種材料的表面均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞固縮和壞死現(xiàn)象，說(shuō)明成骨細(xì)胞可在其表面生長(zhǎng)、增殖，因此判定材料合格，無(wú)細(xì)胞毒性。

表5 成骨細(xì)胞于TNZS基生物材料表面培養(yǎng)72 h的相對(duì)增值率(RGR)和細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)

3 結(jié)論

1) 采用粉末冶金法制備TNZS合金(Ti-24Nb- 4Zr-7.9Sn)以及TNZS-5Cu，TNZS-5Ag 和TNZS-5Co等4種TNZS基生物材料。在SD大鼠成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，TNZS-5Cu，TNZS-5Ag和TNZS-5Co材料表面細(xì)胞培養(yǎng)3，5和7 d時(shí)的細(xì)胞增值抑制率CPIR均低于TNZS材料的，說(shuō)明在Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn基材料中添加5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Cu，Ag或Co均能提高成骨細(xì)胞的增殖能力。

2) TNZS-5Ag材料表面所貼附的大鼠成骨細(xì)胞形貌和伸展度最好，其次是TNZS-5Co，而TNZS-5Cu和TNZS表面的細(xì)胞貼附能力相對(duì)較弱。

3) 4種TNZS基生物植入體材料的細(xì)胞毒性等級(jí)均為2級(jí)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)定可知，這4種TNZS基材料均符合生物醫(yī)用植入體材料的細(xì)胞毒性要求。

4) 通過(guò)Cu，Ag，Co與TNZS基材料復(fù)合，可在一定程度上提高TNZS基材料的體外組織相容性，改善TNZS基材料的綜合性能。

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In vitro histocompatibility of TNZS-based biomaterials

ZHAO Qian

(Jingjiang College, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Ti, Nb, Zr, Sn, Cu, Ag and Co powders were used as the raw materials, Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn(TNZS), TNZS-5Cu, TNZS-5Ag and TNZS-5Co (mass fraction, %) alloys were prepared by high-energy ball milling, cold pressing and vacuum sintering. SD rat osteoblasts were inoculated in dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) with 10% fetal calf serum (FBS) and subcultured, and the cell proliferation, cell adhesion and cytotoxicity experiments were carried out. The results showed that addition of 5% Cu, Ag and Co to TNZS alloys could improve the proliferation of osteoblasts to a certain extent. The surface of TNZS-5Co alloy was the most favorable to promote cell adhesion at the early stage of culture (24 h and 72 h). At the later stage of culture (120 h and 168 h), TNZS-5Cu and TNZS-5Ag alloys were more favorable for the adhesion of osteoblasts. The morphology and elongation of osteoblasts attached to the surface of TNZS-5Ag were the best, followed by TNZS-5Co, while the cell adhesion ability of TNZS and TNZS-5Cu were relatively weak. The cytotoxicity grade of the four materials was level 2, which showed that all of them met the cytotoxicity requirements of the biomedical implant materials.

TNZS alloy; biomedical materials; powder metallurgy; tissue; performance

TG146+2

A

1673-0224(2020)04-352-06

2020?04?20；

2020?05?10

趙倩，碩士。電話(huà)：13921582276；E-mail: Qzhao666@163.com

(編輯 湯金芝)