環(huán)境濃度下鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生態(tài)毒理效應(yīng)

嚴(yán)晨之， 曹 雪， 周 磊,3*， 修光利,3

1.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院, 國(guó)家環(huán)境保護(hù)化工過(guò)程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237 2.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院, 上海市環(huán)境保護(hù)化學(xué)污染物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237 3.上海污染控制與生態(tài)安全研究院, 上海 200092

PAEs (phthalatic acid esters，鄰苯二甲酸酯)是一類常用的增塑劑，用于提高塑料的柔韌性和彈性，也被廣泛應(yīng)用于化妝品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、食品包裝和醫(yī)療產(chǎn)品等領(lǐng)域，屬于內(nèi)分泌干擾物[1-2]. 目前全世界范圍內(nèi)廣泛使用的PAEs包括DEHP 〔di-(2-etylhexyl) phthalate，鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯〕、DBP (dibutyl phthalate，鄰苯二甲酸二丁酯)、DIBP (diisobutyl phthalate，鄰苯二甲酸二異丁酯)[3]. 由于在人類生產(chǎn)活動(dòng)中的大量使用和較高的持久性，PAEs已成為普遍存在的環(huán)境污染物. 該類物質(zhì)能以浸出、遷移、蒸發(fā)等方式進(jìn)入環(huán)境，通過(guò)皮膚接觸、呼吸、飲食等途徑被人體吸收、攝入，最終對(duì)人體產(chǎn)生潛在的危害作用[4-5]. PAEs的暴露引起了人們的關(guān)注，其與人類的健康風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，特別是易感人群，如孕婦、嬰兒和兒童等[6].

研究[7]表明，DEHP等傳統(tǒng)PAEs對(duì)環(huán)境和人體存在顯著毒性影響，因此歐盟出臺(tái)了相關(guān)政策禁止該類物質(zhì)在玩具和嬰幼兒用品中使用，新的PAEs作為替代品被引入. DEP (diethyl phthalate，鄰苯二甲酸二乙酯)作為一種新型增塑劑，已經(jīng)在各行各業(yè)中被廣泛使用[8]. 因其大量被工業(yè)化生產(chǎn)并使用，使得DEP在水、土壤、大氣環(huán)境介質(zhì)中不斷被檢出[9]. 研究[10]表明，DEP在飲用水、工業(yè)廢水、河流中的濃度分別為 0.000 01～0.004 6、0.000 01～0.060、0.000 06～0.044 mgL；在室內(nèi)空氣中的濃度為1.6～2.03 μgm3，在室外空氣中的濃度為0.4～0.52 μgm3. 此外，在食品中也檢測(cè)到了DEP的存在，其在紙包裝材料、瓶裝水及牛奶中的含量分別為41 mgkg、0.02～0.25 μgL、0.22～1.45 μgL[11]. DEP是小分子量的PAEs，與其他PAEs相比，其因缺乏與主體材料結(jié)合的共價(jià)鍵而具有相對(duì)高的水溶性，所以DEP更容易進(jìn)入水生環(huán)境，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體造成影響. 已有研究[12-13]報(bào)道，DEP暴露會(huì)降低生物體內(nèi)的抗氧化性能、引起細(xì)胞凋亡，還能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)，影響兒童的智力發(fā)育等，具有“三致”毒性. 平令文等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在DEP(0.1～50 mgkg)脅迫下,蚯蚓機(jī)體和DNA出現(xiàn)一定程度的損傷，蚯蚓的抗氧化酶防御系統(tǒng)呈激活狀態(tài)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生態(tài)毒理效應(yīng). Shirsha等[15]發(fā)現(xiàn)，暴露于DEP的小鼠精子中存在大量的結(jié)構(gòu)異常，精子功能下降，揭示了PARP-1 (poly ADP-ribose polymerase，DNA修復(fù)酶)的過(guò)度激活以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的精子分裂是DEP介導(dǎo)精子病理的關(guān)鍵機(jī)制. XU等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于DEP會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)生潛在的神經(jīng)毒性影響，在DEP濃度為500 μgL時(shí)影響尤為顯著；在DEP濃度為50 μgL時(shí)，會(huì)影響斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)的ROS(活性氧自由基)水平、干擾氧化平衡、破壞免疫系統(tǒng). HU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在DEP濃度為10～100 mgkg的毒性范圍內(nèi)，小鼠的體質(zhì)量顯著下降，體內(nèi)胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞變小，個(gè)數(shù)增加，對(duì)子宮發(fā)育產(chǎn)生不利影響. 目前，DEP已經(jīng)被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局確認(rèn)為優(yōu)先控制的有毒污染物之一，同時(shí)我國(guó)也將其確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物之一[19]. 然而，作為傳統(tǒng)PAEs的替代品，DEP的毒性效應(yīng)卻尚未引起關(guān)注.

秀麗隱桿線蟲(chóng)廣泛存在于土壤孔隙水中，其通體透明，壽命和生命周期短易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)觀察[20]. 目前，秀麗隱桿線蟲(chóng)已經(jīng)完成全基因組測(cè)序，其與人體60%～80%的基因有相似性，且與人類共同擁有17條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的12條[21]. 近年來(lái)，秀麗隱桿線蟲(chóng)已經(jīng)發(fā)展成一種環(huán)境毒理學(xué)研究的重要?jiǎng)游锬Ｐ?，它?duì)環(huán)境毒性非常敏感，能用多種指標(biāo)測(cè)試終點(diǎn)來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)[22]. 該研究選擇秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬、頭部擺動(dòng)頻率3個(gè)生理指標(biāo)來(lái)評(píng)估暴露于環(huán)境濃度的DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為的影響，選取ROS、細(xì)胞凋亡和脂褐素水平3個(gè)生化指標(biāo)來(lái)闡明影響秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為變化的原因，以期為評(píng)估DEP的生態(tài)安全性提供理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要儀器試劑

儀器：舜宇光學(xué)科技(集團(tuán))有限公司SZM45B1型體視顯微鏡；尼康儀器(上海)有限公司Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡；奧林巴斯(中國(guó))有限公司CX31生物顯微鏡；上海申安醫(yī)療機(jī)械廠LDZF立式高壓滅菌器；上海一恒科技有限公司LRH生化培養(yǎng)箱.

試劑： DEP (純度為99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);二甲基亞砜(DMSO，純度為99%，上海吉至生化科技有限公司)；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA，純度為97%，阿拉丁試劑上海有限公司)；吖啶橙(C17H19N3，純度為99%,阿拉丁試劑上海有限公司).

1.2 秀麗隱桿線蟲(chóng)培養(yǎng)和同步化方法

將處于產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線蟲(chóng)〔N2野生型，購(gòu)于國(guó)線蟲(chóng)遺傳中心(CGC)〕從NGM (nematode growth medium，線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上沖洗至離心管中,加入等體積裂解液(1.6 molL NaOH、3.3% HClO)，搖晃至充分混勻，在 3 000 rmin轉(zhuǎn)速下離心2 min，吸除上層液體，底部沉淀用無(wú)菌K液清洗，清洗3遍，最終得到的裂解后蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)移到涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上，在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h得到L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)用于72 h暴露試驗(yàn)，培養(yǎng)48 h得到L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)用于24 h和10 d暴露試驗(yàn)[23].

1.3 DEP溶液的配置及染毒方法

1.3.1DEP溶液的配置

因DEP不溶于水，故選擇DMSO作為助溶劑(最終體積分?jǐn)?shù)為0.01%). 采用等梯度稀釋法配置DEP溶液. 由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，24 h DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的LC50 (半致死濃度)為27.591 mg/L，根據(jù)DEP環(huán)境濃度范圍及LC50，試驗(yàn)配置的DEP溶液濃度為0(對(duì)照組)、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2 mg/L.

1.3.2染毒方法

根據(jù)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生命周期特點(diǎn)，選取24 h、72 h、10 d作為暴露時(shí)間. 根據(jù)傳統(tǒng)線蟲(chóng)暴露試驗(yàn)方法(急性、亞急性、慢性暴露)，將L1期的秀麗隱桿線蟲(chóng)于DEP濃度為0、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2 mg/L的溶液中暴露72 h，將L4期的秀麗隱桿線蟲(chóng)于DEP濃度為0、0.000 2、0.002、0.02、0.2、2 mg/L的溶液中暴露24 h或10 d.

1.4 體長(zhǎng)和體寬的測(cè)定

暴露試驗(yàn)結(jié)束后，將秀麗隱桿線蟲(chóng)從DEP溶液中吸出，用無(wú)菌K液沖洗3遍. 高溫殺死收集到的秀麗隱桿線蟲(chóng)，吸取部分秀麗隱桿線蟲(chóng)置于載玻片上，將載玻片置于生物顯微鏡下進(jìn)行拍攝，將捕獲到的圖片利用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測(cè)量每條秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)和體寬，每組至少處理60條秀麗隱桿線蟲(chóng)[24].

1.5 頭部擺動(dòng)頻率的測(cè)定

將暴露試驗(yàn)結(jié)束后的秀麗隱桿線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到未涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上，置于生物顯微鏡下，待其穩(wěn)定1 min后再進(jìn)行觀察. 秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部從一側(cè)擺動(dòng)到另一側(cè)記為1次，記錄1 min內(nèi)秀麗隱桿線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率，每組記錄30條秀麗隱桿線蟲(chóng)[25].

1.6 ROS的測(cè)定

暴露試驗(yàn)結(jié)束后，收集秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行ROS測(cè)定. 用H2DCFDA (2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯)熒光探針?lè)▉?lái)檢測(cè)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)ROS的水平[26]. 收集不同暴露濃度下的秀麗隱桿線蟲(chóng)于離心管中，用無(wú)菌K液沖洗3遍，然后在各暴露濃度組中分別加入1 mL 1 μmol/L的H2DCFDA，放入20 ℃的無(wú)菌生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后取出. 用無(wú)菌K液沖洗3遍，將處理后的秀麗隱桿線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂墊上，并用60 μmol/L的左旋咪唑溶液麻醉，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡(日本)下進(jìn)行拍攝〔熒光顯微鏡濾鏡選擇異硫氰酸熒光素(FITC)〕，觀察在DEP溶液中暴露后秀麗隱桿線蟲(chóng)各部分的ROS水平.

1.7 脂褐素的測(cè)定

DEP溶液暴露結(jié)束后，收集秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行脂褐素測(cè)定. 將收集的秀麗隱桿線蟲(chóng)用無(wú)菌K液沖洗3遍后轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂墊上，并用60 μmol/L的左旋咪唑溶液麻醉，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡(熒光顯微鏡濾鏡選擇UV-2A)下進(jìn)行拍攝，觀察在DEP溶液中暴露后秀麗隱桿線蟲(chóng)各部分的脂褐素水平[27].

1.8 細(xì)胞凋亡水平的測(cè)定

DEP溶液暴露結(jié)束后，收集秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平測(cè)定. 用吖啶橙染色法來(lái)檢測(cè)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的細(xì)胞凋亡水平[28]. 收集暴露后的秀麗隱桿線蟲(chóng)用無(wú)菌K液沖洗3遍，不同暴露組分別加入1 mL 25 μg/mL的吖啶橙溶液，放入20 ℃的無(wú)菌生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后取出. 用無(wú)菌K液沖洗3遍，將處理后的秀麗隱桿線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂墊上，并用60 μmol/L的左旋咪唑溶液麻醉，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡(熒光顯微鏡濾鏡選擇FITC)下進(jìn)行拍攝，觀察在DEP溶液中暴露后秀麗隱桿線蟲(chóng)各部分的細(xì)胞凋亡水平.

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，利用SPSS 24軟件進(jìn)行單因素方差(one way ANOVA)分析，采用Origin 2018軟件繪圖；同時(shí)，采用Dunnett假定等方差進(jìn)行事后檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)無(wú)觀察效應(yīng)濃度(nonlinear optimal excitation control, NOEC)[29].

2 結(jié)果與分析

2.1 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育的影響

由圖1可見(jiàn)：L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露24 h后，其體長(zhǎng)和體寬均未發(fā)生顯著性變化. L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于2 mgL DEP溶液中72 h后，體長(zhǎng)出現(xiàn)了顯著性下降，與對(duì)照組相比下降了3.21%(P<0.05)；暴露于 0.000 2 mg/L DEP溶液中秀麗隱桿線蟲(chóng)的體寬增長(zhǎng)；暴露于0.02和0.2 mg/L DEP溶液下秀麗隱桿線蟲(chóng)的體寬均顯著增加，與對(duì)照組相比分別增加了5.07%(P<0.05)和7.11%(P<0.01)；暴露于2 mg/L DEP溶液下秀麗隱桿線蟲(chóng)的體寬有所下降，與暴露于0.2 mg/L DEP溶液下的秀麗隱桿線蟲(chóng)相比，其體寬下降了7.78%. L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露10 d后，其體長(zhǎng)和體寬均呈下降趨勢(shì). 暴露于 0.000 2 mg/L DEP溶液時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)明顯下降，與對(duì)照組相比下降了3.72%(P<0.01)；暴露于0.002和0.02 mg/L DEP溶液時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體寬與對(duì)照組相比分別下降了7.62%和5.96%，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 可見(jiàn)，暴露72 h后DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬影響的NOEC值分別為0.2和0.002 mg/L；暴露10 d后DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬影響的NOEC值均為 0.000 2 mg/L.

2.2 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的影響

注： *和** 分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)，下同.圖1 不同濃度DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育的影響Fig.1 The effect of different DEP concentrations on the developmental endpoints of C. elegans

該研究選取秀麗隱桿線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率作為運(yùn)動(dòng)行為的評(píng)價(jià)指標(biāo). 由圖2可見(jiàn)：L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露24 h后，秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率均減緩，暴露于0.002 mg/L DEP溶液時(shí)顯著下降了2.79%(P<0.01)；L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)在 0.000 2 mg/L DEP溶液中暴露72 h后，秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率明顯加快，與對(duì)照組相比升高了5.52%(P<0.01)，并且隨著DEP濃度的增加，頭部擺動(dòng)頻率呈劑量依賴性增加；L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露10 d后，秀麗隱桿線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率均減緩，但不同暴露濃度之間沒(méi)有顯著性差異. 可見(jiàn)，暴露24 h后DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率影響的NOEC值為 0.000 2 mg/L，暴露72 h后DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率影響的NOEC值為 0.000 2 mg/L；同時(shí)，暴露于DEP溶液10 d后秀麗隱桿線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)速率較暴露于DEP溶液24和72 h時(shí)均減緩，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間暴露于DEP溶液會(huì)導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)行為上的缺陷.

圖2 不同濃度DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率的影響Fig.2 The effect of different DEP concentrations on head thrashes frequency of C. elegans

2.3 DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生化水平的影響

2.3.1DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)ROS水平的影響

ROS包含H2O2和羥基自由基等. 在正常情況下生物體內(nèi)的氧化和抗氧化過(guò)程會(huì)維持動(dòng)態(tài)平衡，一旦外界環(huán)境對(duì)生物體產(chǎn)生刺激作用，生物體內(nèi)ROS累積，則會(huì)打破生物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，從而引起生物體的氧化應(yīng)激損傷[30]. 該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液24 h后，DEP并未干擾秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)情況. 由圖3可見(jiàn)：當(dāng)L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液10 d后，在DEP濃度為 0.000 2～0.2 mg/L時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平略有上升，但沒(méi)有顯著性變化；而DEP濃度為2 mg/L時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)ROS水平出現(xiàn)了顯著性增長(zhǎng)，可以明顯觀察到線蟲(chóng)體內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，出現(xiàn)局部性亮塊，與對(duì)照組相比升高了8.80%(P<0.05). 可見(jiàn)，DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)ROS水平影響的NOEC值為0.2 mg/L，隨著暴露濃度的升高，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧累積程度增加，出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷現(xiàn)象.

2.3.2DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)脂褐素水平的影響

注： 各生化指標(biāo)水平計(jì)算公式為(試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度對(duì)照組熒光強(qiáng)度)×100%.圖3 暴露于DEP溶液10 d對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生化指標(biāo)的影響Fig.3 The effect of DEP on the biochemical endpoints of C.elegans under 10 d exposure

脂褐素是秀麗隱桿線蟲(chóng)面對(duì)周圍不利環(huán)境時(shí)做出反應(yīng)的重要生物指標(biāo). 脂褐素水平在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)累積越高，說(shuō)明其體內(nèi)細(xì)胞損傷程度越高. 由圖3可見(jiàn)：L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液10 d后秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素累積增加. 在DEP濃度為 0.000 2～0.2 mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平均沒(méi)有出現(xiàn)顯著變化；而在DEP濃度為2 mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素積累增長(zhǎng)了21.81%(P<0.05)，可以觀察到線蟲(chóng)體內(nèi)熒光強(qiáng)度增加. 可見(jiàn)，DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)脂褐素水平影響的NOEC值為0.2 mg/L，脂褐素水平累積增長(zhǎng)，秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞損傷情況加劇，最終對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響.

2.3.3DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡水平的影響

細(xì)胞凋亡是指正常細(xì)胞受到不利環(huán)境的刺激，最終死亡的過(guò)程[31]. 細(xì)胞凋亡也是用于評(píng)價(jià)環(huán)境污染物毒性的重要指標(biāo). 由圖3可見(jiàn)，L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于 0.000 2～0.2 mg/L的DEP溶液10 d后，體內(nèi)細(xì)胞凋亡水平并未出現(xiàn)顯著改變，而在DEP濃度為2 mg/L時(shí)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞凋亡水平顯著上升了8.61%(P<0.05)，可以明顯觀察到線蟲(chóng)體內(nèi)熒光亮度較對(duì)照組增強(qiáng). 可見(jiàn)，DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡水平影響的NOEC值為0.2 mg/L，推測(cè)DEP溶液會(huì)通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，最終導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞凋亡.

3 討論

PAEs是一種環(huán)境類激素污染物，其對(duì)生物體的生殖發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)都會(huì)造成功能性損害[32]. 日常生活中塑料制品的廣泛使用，使得PAEs大量存在于各種環(huán)境介質(zhì)中. 該研究發(fā)現(xiàn)，DEP暴露會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為造成缺陷，且不同暴露劑量和暴露時(shí)間都會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)生不同程度的毒性影響.

L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于不同濃度的DEP溶液24 h后，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)體寬并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性變化，僅頭部擺動(dòng)頻率出現(xiàn)變化，這可能與DEP在生物體內(nèi)的水解代謝和排出速率相對(duì)較快有關(guān)[33]. 短時(shí)間暴露于DEP溶液時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)將DEP從體內(nèi)代謝排出，所以并未對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng). 而將L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液72 h后，0.000 2～0.02 mgL的DEP溶液便可影響秀麗隱桿線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為. 研究[34]發(fā)現(xiàn)，周圍環(huán)境變化或暴露于污染物質(zhì)時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)行為均會(huì)發(fā)生改變，而其運(yùn)動(dòng)行為的變化又主要由多種神經(jīng)元及相互間的神經(jīng)傳導(dǎo)信號(hào)通路控制. XU等[16]發(fā)現(xiàn)，DEP溶液對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生了神經(jīng)毒性，斑馬魚(yú)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性受到抑制且神經(jīng)基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化. 秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的改變進(jìn)而導(dǎo)致攝食行為的變化，最終對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響. 在L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液72 h的試驗(yàn)中，暴露于0.02 mgL的DEP溶液時(shí)秀麗隱桿線蟲(chóng)體寬增加，同時(shí)其頭部擺動(dòng)頻率加快，說(shuō)明秀麗隱桿線蟲(chóng)極有可能以促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的形式來(lái)彌補(bǔ)暴露后對(duì)其運(yùn)動(dòng)行為造成的不利影響. 此外，L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液10 d后，秀麗隱桿線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)行為均出現(xiàn)缺陷，體內(nèi)生化指標(biāo)發(fā)生變化，出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞損傷情況. 其中，ROS作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，可通過(guò)干擾抗氧化和氧化系統(tǒng)的平衡來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速秀麗隱桿線蟲(chóng)的衰老死亡，干擾秀麗隱桿線蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育水平[35-37]. Pradhan等[8]研究了DEHP和DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)脂質(zhì)代謝、繁殖能力和壽命的影響，發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄均受到DEHP和DEP的影響，其中ced-1、wah-1、gst-4、cth-2，hsp16基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，最終損害脂質(zhì)代謝、降低繁殖能力、縮短秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命.

通過(guò)比較DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬、頭部擺動(dòng)頻率和3個(gè)生化指標(biāo)影響的NOEC值可以發(fā)現(xiàn)，L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液24 h時(shí)，未檢出DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)和體寬影響的NOEC值，DEP對(duì)頭部擺動(dòng)頻率影響的NOEC值為 0.000 2 mg/L；L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液72 h時(shí)，DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬和頭部擺動(dòng)頻率影響的NOEC值分別為0.2、0.002、0.000 2 mg/L；L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液10 d時(shí)，未檢出DEP對(duì)秀麗隱桿線頭部擺動(dòng)頻率影響的NOEC值，DEP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬影響的NOEC值均為 0.000 2 mg/L，對(duì)ROS、脂褐素和細(xì)胞凋亡水平影響的NOEC值均為0.2 mg/L. 在同一暴露時(shí)間下，不同生理指標(biāo)的敏感性不同. 在DEP溶液中暴露24 h時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)生理指標(biāo)的敏感性順序?yàn)轭^部擺動(dòng)頻率>體長(zhǎng)、體寬；在DEP溶液中暴露72 h時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)生理指標(biāo)的敏感性順序?yàn)轭^部擺動(dòng)頻率>體寬>體長(zhǎng)；在DEP溶液中暴露10 d時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)生理指標(biāo)的敏感性順序?yàn)轶w長(zhǎng)、體寬>頭部擺動(dòng)頻率. 對(duì)于生化指標(biāo)而言，在DEP溶液中暴露10 d時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)3個(gè)生化指標(biāo)的敏感性一致.

該研究也發(fā)現(xiàn)，只有在較高濃度(0.2和2 mg/L)或長(zhǎng)期暴露(72 h和10 d)情況下，DEP才會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的毒性效應(yīng)，在低濃度或短時(shí)間暴露情況下，DEP并未對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的毒性效應(yīng)，這可能是由于PAEs類物質(zhì)的毒性與其溶解度成反比，且與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[38]. DEP有較高的水溶性且分子結(jié)構(gòu)較小，單獨(dú)存在時(shí)毒性弱于與其他物質(zhì)混合時(shí)的毒性. 環(huán)境中PAEs類物質(zhì)經(jīng)常是以混合物的形式存在，DEP的加入可能會(huì)導(dǎo)致化合物的協(xié)同作用，使得混合存在的PAEs毒性增強(qiáng)[39]. 與暴露于DEHP后秀麗隱桿線蟲(chóng)表現(xiàn)出的急性毒性[40]相比，暴露于DEP溶液中也對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)生了毒性影響. 因DEP在環(huán)境中的持久性及生物富集性，其對(duì)于人體的危害影響仍不能忽視.

4 結(jié)論

a) L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露24 h后，與對(duì)照組相比，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬均未受到顯著影響，表明短時(shí)間暴露于DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著性影響.

b) L1期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露72 h后，在DEP溶液濃度為2 mgL時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)顯著下降了3.21%；在DEP溶液濃度為 0.000 2 mgL時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體寬呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，頭部擺動(dòng)頻率顯著增加了5.52%. 結(jié)果表明，將生長(zhǎng)期的秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為造成缺陷.

c) L4期秀麗隱桿線蟲(chóng)在不同濃度DEP溶液中暴露10 d后，在DEP溶液濃度為 0.000 2 mgL時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)明顯下降了3.72%；在DEP溶液濃度為0.002 mgL時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)的體寬下降了7.62%. 暴露于DEP溶液使得秀麗隱桿線蟲(chóng)的體長(zhǎng)體寬下降，頭部擺動(dòng)頻率減緩，體內(nèi)ROS、脂褐素及細(xì)胞凋亡水平累積上升，尤其是在DEP溶液濃度為2 mgL時(shí)表現(xiàn)最為顯著. 結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間(10 d)及高濃度DEP溶液(2 mgL)暴露會(huì)嚴(yán)重誘發(fā)秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的缺陷，擾亂秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)系統(tǒng)平衡.

d) 對(duì)比不同濃度DEP溶液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬和頭部擺動(dòng)頻率影響的NOEC值發(fā)現(xiàn)：秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液72 h時(shí)各指標(biāo)敏感性大于暴露24 h和10 d時(shí)的情況. 此外，秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液24 h和72 h時(shí)，頭部擺動(dòng)頻率為最敏感的生理指標(biāo)；秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液10 d時(shí)，體長(zhǎng)和體寬為較敏感的生理指標(biāo). 秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于DEP溶液10 d后,ROS、脂褐素和細(xì)胞凋亡水平這3個(gè)生化指標(biāo)敏感性一致.