“邵氏五針法”對慢性哮喘大鼠GATA-3/T-bet表達(dá)的影響?

華金雙，邵素菊，鄭 潔，何竹青，楊京京，胡曉京，徐 寧，田 麗

(河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，鄭州 450046)

支氣管哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、可逆性氣道阻塞和氣道重塑為主要特征的慢性氣道疾病[1]。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為支氣管哮喘是一種免疫異常導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)性疾病，免疫功能紊亂在哮喘發(fā)病中起十分重要的作用，而輔助性T細(xì)胞在其中更是發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[2]。Thl/Th2細(xì)胞失衡被認(rèn)為是哮喘免疫學(xué)機(jī)制的發(fā)病基礎(chǔ)，尤其是向Th2細(xì)胞的偏移，因此糾正和阻止Thl/Th2細(xì)胞失衡是治療支氣管哮喘的關(guān)鍵和目標(biāo)。Th2細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3(GATA-3)，促進(jìn)B細(xì)胞增殖及IgE合成，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Th2功能亢進(jìn)時，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在效應(yīng)部位趨化、募集并活化，釋放活性物質(zhì)，引起氣道炎癥的蔓延。本實(shí)驗(yàn)旨在探討以“邵氏五針法”為主的針灸方法對慢性哮喘大鼠免疫機(jī)制的影響，揭示針灸對哮喘大鼠Th1/Th2的上下游基因及細(xì)胞因子T-bet、GATA-3、白介素(IL)-5、γ干擾素(IFN-γ)的調(diào)控，從多角度、多層次闡明針灸治療慢性哮喘的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料

1.1 動物及分組

SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量160 g～180 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SCXK(豫)2017-0001。將大鼠在SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，期間自由飲食。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組。本實(shí)驗(yàn)已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查。

1.2 試劑及儀器

IL-5、IFN-γ大鼠血清Elisa試劑盒(貨號分別為CK-E30490R、CK-E30654R，蘇州卡爾文生物科技有限公司)；卵蛋白(OVA，美國Sigma公司)；氫氧化鋁干粉、生理鹽水、針灸針(0.30 mm×13 mm)；細(xì)艾條(0.7 cm×12 cm，湖香艾生物科技有限公司)；NE-C30型壓縮式霧化器(大連歐姆龍有限公司)；RM2015型切片機(jī)(德國Leica公司)；BX43型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMpUS公司)；計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)CMOS(日本OLYMPUS公司)及專用軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-pro plus)；ABI7500型熒光定量PCR儀。

2 方法

2.1 造模方法

參考palmans等[3-4]方法制備慢性哮喘大鼠模型。

2.1.1 致敏 除空白組用生理鹽水外，其余各組動物均以新鮮配制的10%復(fù)合OVA抗原溶液(每1 ml抗原液中含有OVA100 mg，氫氧化鋁干粉100 mg)1ml進(jìn)行腹腔注射致敏。在實(shí)驗(yàn)的第1、8天各注射1次共2次，使大鼠致敏。

2.1.2 激發(fā) 在實(shí)驗(yàn)的第15天將大鼠置于密閉的霧化箱內(nèi)，由壓縮霧化器噴入1%的卵蛋白溶液30 min激發(fā)哮喘，隔天1次，連續(xù)6周。激發(fā)時大鼠出現(xiàn)呼吸急促，喘息，噴嚏，煩躁不安，行動遲緩甚至俯伏不動，連續(xù)激發(fā)后上述癥狀加重，毛色暗淡無光澤，活動減少，反應(yīng)遲緩即為造模成功。

2.2 各組大鼠處理方法

2.2.1 針刺組 取穴肺俞(雙)、大椎、風(fēng)門(雙)、足三里，每次激發(fā)前針刺隔日1次，連續(xù)6周。操作：常規(guī)消毒后以0.30 mm×13 mm針灸針直刺大椎、風(fēng)門(雙)、肺俞(雙)、足三里，大椎直刺5 mm，風(fēng)門、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm，每隔10 min均勻提插捻轉(zhuǎn)1次，每次留針20 min。

2.2.2 艾灸組 取穴同針刺組。每次激發(fā)前實(shí)驗(yàn)人員手持細(xì)艾條行溫和灸法，使艾條距離上述穴位約2～3 cm，每次灸15 min，隔日1次，連續(xù)6周。

2.2.3 空白組和模型組 空白組按照模型制備方法，用生理鹽水代替卵蛋白；模型組按照模型制備方法造模，2組大鼠每天給予同樣的抓握刺激，不做任何治療。

2.3 取材方法

每組最后1次治療結(jié)束后24 h內(nèi)用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 ml/100 g)，脫頸椎處死大鼠后迅速打開胸腔暴露心臟，用l0ml注射器抽取血液置于普通試管，靜置30 min，離心(3000 r/min，10 min)后取上清，-20 ℃保存。取右肺中下葉，用4 ℃生理鹽水將其漂洗干凈后，立即放入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)變化。取左肺組織黃豆粒大小，用4 ℃生理鹽水漂洗血跡，放入DEPC處理過的2 ml凍存管內(nèi)，投入液氮罐，3 h內(nèi)置-70 ℃冰箱凍存，待用于RT-PCR檢測。

2.4 肺組織病理切片

肺組織常規(guī)石蠟包埋，二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素染色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 血清IL-5、IFN-γ含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清 IL-5、IFN-γ含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

2.6 肺組織T-bet、GATA-3mRNA檢測

表1示，用Trizol提取組織樣本中總RNA，使用PCR儀將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，各樣品目的基因和內(nèi)參基因引物序列及其產(chǎn)物長度，PCR反應(yīng)條件：95℃15 min，95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，40循環(huán)，可得到模板循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，其中橫坐標(biāo)代表PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，即Ct值。根據(jù)Real Time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果。

表1 T-bet、GATA-3基因定量PCR引物序列

圖1 各組大鼠肺組織切片HE染色(×400)

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)分析

空白組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常，肺泡及肺泡間隔形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，支氣管管腔規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠氣管、肺間質(zhì)、小血管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管管腔狹窄，氣道黏膜水腫明顯，可見上皮細(xì)胞脫落。針刺組和艾灸組同樣可見氣管及其周圍炎性細(xì)胞浸潤，氣道黏膜水腫，但與模型組比較炎性細(xì)胞浸潤程度明顯降低。

3.2 各組大鼠血清IL-5、IFN-γ含量及肺組織T-bet、GATA-3mRNA表達(dá)

表2示，與空白組比較，模型組大鼠IL-5含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組和艾灸組IL-5含量均明顯降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠IFN-γ含量明顯降低(P<0.01)，與模型組比較，針刺組和艾灸組IFN-γ含量均明顯升高(P<0.01)，針刺組和艾灸組血清IL-5、IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組大鼠血清IL-5、IFN-γ含量及肺組織T-bet、GATA-3mRNA表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組大鼠T-bet mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，針刺組和艾灸組T-betmRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠GATA-3 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，針刺組和艾灸組GATA-3mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。針刺組和艾灸組肺組織T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

4 討論

支氣管哮喘是一種免疫異常導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其中Thl/Th2失衡理論被認(rèn)為是哮喘形成和發(fā)展的重要原因。Th2 細(xì)胞是CD4+輔助性T細(xì)胞的重要亞群，主要分泌IL-4、IL-5、IL-13、腫瘤壞死因子(TNF-a)等，其中IL-4主要促進(jìn)B細(xì)胞增殖及IgE合成[5]，IL-5 能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，IL-13通過促進(jìn)黏液分泌和加重氣道高反應(yīng)性而引發(fā)哮喘。GATA-3是Th2細(xì)胞分化必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)在Th2譜系分化的細(xì)胞中顯著上調(diào)[6]。研究證明，GATA-3可以驅(qū)動Th2細(xì)胞分化和誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，IL-4、IL-5 和 IL-13 的基因啟動子區(qū)域都包含有GATA-3的結(jié)合位點(diǎn)，GATA-3通過上調(diào)IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)，加重氣道的炎癥浸潤，促進(jìn)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。另一方面，GATA-3還可通過抑制Thl特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，對多種靶基因起到促進(jìn)和抑制作用[7]。T-bet是Thl的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)Th1譜系細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵作用[8]，能夠阻斷或抑制Th2的分化信號，還能誘導(dǎo)已經(jīng)定向分化的Th2細(xì)胞向相反的Thl方向轉(zhuǎn)化。在T-bet基因完全敲除的大鼠能夠發(fā)現(xiàn)與過敏哮喘相類似的病理炎癥改變[9]。Th1細(xì)胞可分泌IFN-γ，IFN-γ與受體結(jié)合后能夠激活T-bet基因，促使細(xì)胞向Th1方向分化，對哮喘的慢性氣道炎癥具有明顯的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，哮喘模型組大鼠血清IL-5含量及GATA-3 mRNA表達(dá)較空白組大鼠明顯升高，而血清IFN-γ含量及T-bet mRNA表達(dá)卻明顯降低，說明GATA-3可能一方面通過誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子IL-5的表達(dá)，導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生；另一方面也有效抑制Thl分泌細(xì)胞因子IFN-γ，阻斷其激活Thl特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet，從而引發(fā)哮喘。錢麗娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GATA-3可直接調(diào)控哮喘小鼠肺組織中IL-5、IL-13表達(dá)，參與哮喘呼吸道炎癥的發(fā)生。這與本研究結(jié)果一致，說明針刺和艾灸可能是通過調(diào)控T-bet、GATA-3等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響IL-5、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而糾正Thl/Th2失衡，發(fā)揮防治哮喘的作用。

本研究采用的技術(shù)方案以全國著名針灸專家邵經(jīng)明集60余年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來的哮喘經(jīng)驗(yàn)處方“邵氏五針法”為主。肺俞是肺的背俞穴，為治療肺系內(nèi)傷外感諸疾之要穴，具有調(diào)補(bǔ)肺氣、祛邪解表、止咳平喘等作用；大椎屬督脈穴，為諸陽之會，具有宣陽解表、祛風(fēng)散寒、理氣降逆、宣肺平喘之功；風(fēng)門屬足太陽膀胱經(jīng)穴，可疏風(fēng)解表，調(diào)理肺氣，止咳平喘。輔以足陽明胃經(jīng)的合穴足三里，具有健脾和胃、培土生金、扶助正氣之功。諸穴合用意在宣肺平喘，扶正固本，提高機(jī)體的抗病能力，減少哮喘的發(fā)作次數(shù)及嚴(yán)重程度。本研究中觀察到，哮喘模型大鼠氣道內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，GATA-3表達(dá)升高，Th2細(xì)胞因子IL-5分泌增加，表現(xiàn)出明顯的向Th2細(xì)胞偏移。針刺組和艾灸組干預(yù)后，GATA-3mRNA及IL-5含量明顯降低，T-betm RNA表達(dá)明顯升高，Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌增加明顯，說明不論針刺或者艾灸均可通過調(diào)節(jié)哮喘大鼠Th1/Th2上下游基因及細(xì)胞因子T-bet、GATA-3、IL-5、IFN-γ的表達(dá)，使Th1/Th2失衡得以糾正，從而降低哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性及慢性炎癥，達(dá)到防治哮喘的作用。