紫球藻對沼液廢水中氨氮、銅離子及抗生素磺胺二甲嘧啶的處理效果

彭 瑤，胡政宇，肖 鵬，許智慧，常 婷，程鵬飛①

(1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

沼氣工程發(fā)展的同時，大量富營養(yǎng)的養(yǎng)豬沼液廢水也對水體環(huán)境以及人類健康造成嚴(yán)重危害[1]。養(yǎng)豬沼液廢水是一種較難處理的有機(jī)廢水，具有氮磷含量高、富含重金屬及抗生素等成分的特點(diǎn)[2]。沼液既是污染源，又是農(nóng)業(yè)資源，沼液富含的養(yǎng)分及生物活性物質(zhì)，在作為生物肥料施用于農(nóng)作物方面具有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。

在現(xiàn)代規(guī)?；曫B(yǎng)過程中，豬糞尿中氨氮(NH3-N)的淋溶性很大，會通過地表徑流滲入地下水體，同時也會在土壤中逐漸積累，導(dǎo)致水體污染嚴(yán)重，破壞水環(huán)境系統(tǒng)平衡[5-6]。沼液廢水中的氨氮在轉(zhuǎn)化成氮?dú)獾倪^程中會產(chǎn)生大量硝酸鹽和亞硝酸鹽，是誘發(fā)高鐵血紅蛋白血癥的主要因素，給人體造成嚴(yán)重危害[7]。另一方面，未經(jīng)處理的含銅離子(Cu2+)廢水進(jìn)入江河湖泊，不僅污染土壤，還會被農(nóng)作物吸收，影響農(nóng)作物生長，造成減產(chǎn)或者更大的損失，同時還可通過植物根系進(jìn)入食物鏈，在人體內(nèi)聚集，給人體帶來不容小覷的危害[8]。研究還發(fā)現(xiàn)，畜禽使用過的抗生素有25%～75%以母體藥物形式從糞尿中排出體外，以代謝產(chǎn)物形式通過禽畜糞尿進(jìn)入水體和土壤中，從而對環(huán)境造成潛在威脅[9]?；前范奏奏な且活愲y降解、易吸附的抗生素，而養(yǎng)豬沼液中含有大量磺胺二甲嘧啶，將其作為肥料施用于農(nóng)田會導(dǎo)致通過食物鏈富集引發(fā)生態(tài)風(fēng)險[10]。

目前，處理沼液廢水的方法主要包括還田應(yīng)用、物理法、化學(xué)法以及厭氧發(fā)酵等工藝[11-12]。規(guī)?；B(yǎng)豬場廢水一般采用厭氧-好氧組合工藝進(jìn)行處理，然而由于厭氧處理后的沼液中含有大量難降解有機(jī)物，且其氮磷含量高，碳氮比低，因此，當(dāng)采用接觸氧化法、序批式活性污泥法(SBR)和氧化溝法等傳統(tǒng)廢水處理方法時，處理效果均不太理想，再加上運(yùn)行不穩(wěn)定，建設(shè)運(yùn)行成本較高，故難以在工程中得到實際運(yùn)用[13-14]。綜上所述，處理養(yǎng)豬沼液廢水中的氨氮、Cu2+以及抗生素(磺胺二甲嘧啶)是確保水環(huán)境達(dá)標(biāo)排放的一項重要任務(wù)。

微藻具有特殊的結(jié)構(gòu)和生理代謝作用，具有良好的生物凈化功能，將其用于水體處理后還能收獲潛在的具有很高應(yīng)用價值的生物量和功能性產(chǎn)品[15]。利用藻類培養(yǎng)處理廢水具有技術(shù)工藝簡單、適應(yīng)性廣和處理效果佳等特點(diǎn)，因而其作為一種新型高效的生物技術(shù)得到了國內(nèi)外的廣泛研究[16]。將沼液的大規(guī)模處理和藻類的工廠化培養(yǎng)進(jìn)行偶聯(lián)，依靠微藻自身細(xì)胞的增殖及營養(yǎng)物質(zhì)的積累，不僅有望使沼液排放達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，還能兼顧成本問題，在實現(xiàn)沼液廢水資源化的同時，可降低微藻培養(yǎng)成本。

紫球藻(Porphyridiumcruentum)是一種單細(xì)胞紅藻[17]，屬于紫球藻科紫球藻屬淡水藻類植物。紫球藻在生長過程中能夠合成大量藻紅蛋白和胞外多糖等多種高值活性物質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景[18]。目前，關(guān)于紫球藻的研究主要集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化改良和多種生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用方面，利用紫球藻培養(yǎng)處理養(yǎng)豬沼液還鮮見報道?；诖耍撐闹饕骄坎煌瑵舛劝钡?、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長的影響，將培養(yǎng)的紫球藻用于處理養(yǎng)豬沼液廢水，進(jìn)而期望實現(xiàn)養(yǎng)豬沼液廢水的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)基

供試紫球藻(Porphyridiumcruentum806)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫饋贈，紫球藻培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)基為KOCK培養(yǎng)基[19]，其成分配方見表1。

表1 KOCK培養(yǎng)基配方

紫球藻培養(yǎng)所用反應(yīng)器為玻璃柱式反應(yīng)器(圖1)，內(nèi)直徑為0.05 m，柱高為0.55 m，反應(yīng)液體積為0.9 L。反應(yīng)器內(nèi)部布置直徑為5 mm的玻璃通氣管，混合有φ(CO2)=1.5%的壓縮空氣(0.1 MPa)以100 mL·min-1速率通過通氣管從反應(yīng)器底部曝氣，使培養(yǎng)過程中的藻液攪動并補(bǔ)充碳源。

1.2 氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長的影響

養(yǎng)豬場厭氧發(fā)酵后的沼液廢水參數(shù)指標(biāo)如下：ρ(氨氮)為512.00 mg·L-1，ρ(TP)為42.00 mg·L-1，ρ(COD)為663.00 mg·L-1，ρ(Cu2+)為0.94 mg·L-1，ρ(磺胺二甲嘧啶)為8.24 mg·L-1。以沼液廢水參數(shù)指標(biāo)為參照，以氯化銨為銨鹽，向KOCK培養(yǎng)基中加入氯化銨(NH4Cl)，分別設(shè)置ρ(氨氮)為50、500和2 000 mg·L-1，并將其與KOCK培養(yǎng)基相比較，考察紫球藻生長情況；在正常KCOK培養(yǎng)基中分別設(shè)置ρ(Cu2+)為0.5、1.0和2.0 mg·L-1，并考察紫球藻生物量積累情況；同時以正常培養(yǎng)基為對照，分別設(shè)置ρ(磺胺二甲嘧啶)為5、10、20、100和200 mg·L-1，考察不同抗生素濃度對紫球藻生長的影響。紫球藻在沼液廢水及KOCK培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中的光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)時間均為10 d。

圖1 紫球藻培養(yǎng)所用柱式反應(yīng)器

1.3 紫球藻細(xì)胞產(chǎn)率的測定

紫球藻細(xì)胞生物量測定采用生物膜干重法。將孔徑為0.45 μm、直徑為50 mm、面積為0.001 m2的醋酸纖維濾膜用去離子水煮沸3次，在105 ℃烘箱中烘8 h至恒重，取出濾膜對其編號稱重并記錄質(zhì)量(W1)，用移液器吸取5 mL待測藻細(xì)胞樣品至抽濾裝置內(nèi)，抽濾至已稱質(zhì)量(W1)的濾膜上，將附著藻的濾膜放入105 ℃烘箱中烘8 h至恒重(W2)，用分析天平稱量，并計算紫球藻細(xì)胞生物量(Wd，g·L-1)，其計算公式為Wd=(W2-W1)/5。紫球藻生物產(chǎn)率為單位培養(yǎng)時間的生物量(g·L-1·d-1)。

1.4 氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶的測定

采用納氏試劑分光光度法(GB 7479—1987)測定氨氮濃度，采用原子吸收光譜法(PinAAcle900T，美國)測定Cu2+濃度；采用高壓液相色譜(Alliance 2695 system，Waters，USA)配備Waters2487UV-VIS檢測器測定廢水中抗生素磺胺二甲嘧啶濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氨氮對紫球藻生長的影響

基于研究的可比性，設(shè)置紫球藻在正常KOCK培養(yǎng)基中及50、500和2 000 mg·L-1氨氮濃度梯度條件下的初始接種密度是一致的(圖2)。

圖2 不同濃度氨氮對紫球藻生長的影響

結(jié)果表明，對照組，50、500和2 000 mg·L-1氨氮處理組紫球藻由初始生長量0.33 g·L-1分別增長至培養(yǎng)10 d時的1.67、1.74、0.85和0.68 g·L-1，相應(yīng)的生物產(chǎn)率分別為0.134、0.141、0.052和0.035 g·L-1·d-1(圖2)。在培養(yǎng)前期(0～4 d)，各實驗組均保持良好生長。培養(yǎng)4 d時，ρ(氨氮)為500、2 000 mg·L-1處理組紫球藻生物量明顯低于正常培養(yǎng)基和50 mg·L-1氨氮處理組。4 d后，正常培養(yǎng)基和50 mg·L-1氨氮處理組生物量較高，且生長速率較快；500 mg·L-1氨氮處理組生物量變化不大；2 000 mg·L-1氨氮處理組生物量比4 d時有所下降，其后雖有所增長，但生物量基本保持在一定范圍內(nèi)。這可能是因為紫球藻對銨態(tài)氮的吸收能力較弱；在不同濃度氨氮條件下，微藻生長趨勢較為緩慢，尤其是在500和2 000 mg·L-1氨氮濃度條件下藻細(xì)胞生長較慢。相對而言，50 mg·L-1氨氮濃度條件下微藻生長較好。一定的氨氮濃度條件下微藻能較好地生長，過低的氨氮濃度導(dǎo)致營養(yǎng)不足，影響微藻的生長代謝，而過高的氨氮濃度則產(chǎn)生較多銨離子而無法迅速轉(zhuǎn)移到氨基酸的合成中，導(dǎo)致微藻生長遲緩或死亡[20]。50 mg·L-1氨氮濃度可能較低，而500和2 000 mg·L-1氨氮濃度則可能超出了紫球藻的耐受范圍，導(dǎo)致藻細(xì)胞生長遲緩。

2.2 不同濃度Cu2+對紫球藻生長的影響

由圖3可知，紫球藻在正常KOCK培養(yǎng)基中和0.5、1.0和2.0 mg·L-1Cu2+濃度梯度條件下的生物量是相當(dāng)?shù)?。在培養(yǎng)前期(0～4 d)，紫球藻在正常培養(yǎng)基中的生長速率較快，其余3個Cu2+濃度處理組生長速率相差不大。4 d之后，正常培養(yǎng)基與0.5、1.0 mg·L-1Cu2+處理組生物量繼續(xù)累積，其中，0.5、1.0 mg·L-1Cu2+處理組生物量累積趨勢基本保持一致；而2.0 mg·L-1Cu2+處理組紫球藻生物量在6 d時出現(xiàn)下降，然后再繼續(xù)生長，這可能是因為培養(yǎng)基氮源減少而Cu2+濃度相對過高，紫球藻需要重新適應(yīng)相應(yīng)的生長環(huán)境。由圖3可知，對照組，0.5、1.0和2.0 mg·L-1Cu2+處理組紫球藻由初始生長量0.93 g·L-1分別增長至2.36、1.81、1.83和1.58 g·L-1，相應(yīng)的生物產(chǎn)率分別為0.143、0.088、0.090和0.065 g·L-1·d-1(圖3)。

圖3 不同濃度Cu2+對紫球藻生長的影響

培養(yǎng)10 d后，Cu2+濃度越高，紫球藻生物產(chǎn)率相對越低，Cu2+處理組生物產(chǎn)率均低于正常培養(yǎng)基處理組。因此，沼液廢水中金屬Cu元素是限制紫球藻生長的關(guān)鍵因子。

2.3 不同濃度磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長的影響

不同濃度磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長的影響見圖4。培養(yǎng)10 d內(nèi)，磺胺二甲嘧啶濃度分別為5、10、20、100和200 mg·L-1處理組紫球藻生物量均低于正常KOCK培養(yǎng)基處理組；培養(yǎng)10 d時上述濃度組紫球藻生物量分別為1.18、1.42、1.30、0.98和0.88 g·L-1，正常培養(yǎng)基處理組生物量為1.60 g·L-1(圖4)。比較不同濃度抗生素處理組發(fā)現(xiàn)，10 mg·L-1磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長的影響相對較小，生物產(chǎn)率較高，為0.12 g·L-1·d-1(圖4)。因此，較低濃度(5、10和20 mg·L-1)磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長影響不大；在這3種濃度中，5 mg·L-1濃度條件下藻細(xì)胞生物量略低于較高濃度(20 mg·L-1)條件下的值，這可能是由于藻細(xì)胞生長代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)抗生素濃度較低所致。但當(dāng)ρ(磺胺二甲嘧啶)為100和200 mg·L-1時藻細(xì)胞生長受到明顯抑制，且濃度越高，抑制效果越明顯。

圖4 不同濃度抗生素磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長的影響

2.4 紫球藻對KOCK培養(yǎng)基中氨氮、Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶的吸附效果

基于上述研究結(jié)果，將紫球藻分別培養(yǎng)于含有最佳濃度污染物的KOCK培養(yǎng)基中(50 mg·L-1氨氮、1.0 mg·L-1Cu2+和10 mg·L-1磺胺二甲嘧啶)，考察藻細(xì)胞對此3類污染物的吸附效果。在相同條件下，紫球藻對氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶的吸附效率分別為(73.2±3.2)%、(54.3±2.8)%和(56.9±3.6)%。一般而言，包括紫球藻在內(nèi)的微藻通過光合作用，能夠有效地吸附水體中微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，如氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶，為藻細(xì)胞生長及其代謝產(chǎn)物的合成提供營養(yǎng)需求，微藻細(xì)胞通過其非均勻表面的單層與多層吸附達(dá)到去除水體中抗生素的效果[21]。而微藻對重金屬的去除大多主要通過物理吸附和化學(xué)吸附(如絡(luò)合、螯合等)方式。筆者研究中，紫球藻對金屬Cu2+及抗生素磺胺二甲嘧啶的具體吸附機(jī)制還需進(jìn)一步的實驗研究。

3 討論

筆者研究主要側(cè)重于紫球藻對養(yǎng)豬沼液中存在的難處理物質(zhì)氨氮、Cu2+及磺胺二甲嘧啶的去除效果。紫球藻富含胞外多糖，其細(xì)胞外層的水溶性多糖是主要由葡萄糖、木糖和半乳糖等組成的易溶于水的多聚體，具有多種特殊的生物活性作用，對氨氮、Cu2+和磺胺二甲嘧啶等具有一定的吸附(去除)效果[22]。不同濃度氨氮對紫球藻生長狀況的影響程度不同(圖2)，筆者將紫球藻分別置于不同濃度氨氮(50、500和2 000 mg·L-1)的KOCK培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果表明，紫球藻在低濃度(50 mg·L-1)氨氮中生長狀況較好，這說明不同濃度氨氮影響紫球藻細(xì)胞組分的合成。一般而言，高濃度氨氮會抑制藻類生長，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著氨氮濃度的適量增加，藻細(xì)胞的生長狀態(tài)會較好，但如果氨氮濃度超過一定的值，將產(chǎn)生氨毒性[19,23-24]，對藻類生長起抑制作用，進(jìn)而限制藻類處理污水的應(yīng)用。另一方面，氨氮濃度過低會抑制浮游藻類生長[25]，而筆者研究中低濃度(50 mg·L-1)氨氮對紫球藻的生長影響不大，這可能與不同藻株對氨的耐受性不同有關(guān)。

養(yǎng)豬沼液廢水中Cu2+濃度較高，高濃度Cu2+對大多數(shù)微生物具有毒性，沼液廢水中Cu2+可以抑制紫球藻生長，從而降低沼液廢水的處理效率[26]。Cu2+是養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中不可或缺的金屬元素，不同濃度Cu2+的累積會引起藻類植物生命過程的改變，如礦物營養(yǎng)、光合作用、酶活性等，從而抑制藻細(xì)胞的生長與代謝[27]。高濃度Cu2+對藻類具有嚴(yán)重的毒性作用，會導(dǎo)致其缺鐵，抑制葉綠素的合成，進(jìn)而影響藻類光合生長[28-29]。由圖3可知，在高濃度Cu2+條件下，紫球藻生物量低于KOCK培養(yǎng)基處理組。紫球藻在2.0 mg·L-1Cu2+濃度條件下生長較差，其生長狀況均低于其他兩組(0.5、1.0 mg·L-1)。紫球藻對ρ(Cu2+)為1.0 mg·L-1的KOCK培養(yǎng)基中Cu2+去除效率為54.3%，所以優(yōu)化Cu2+濃度是紫球藻處理含Cu2+沼液廢水的重要條件[30]。同樣，在利用沼液養(yǎng)殖紫球藻過程中若優(yōu)化氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶濃度，則可使紫球藻對其的去除效果達(dá)到最優(yōu)。

不同濃度磺胺二甲嘧啶對紫球藻的生長影響不同，藻類對磺胺二甲嘧啶的敏感性差異很大，有的抗生素對藻類有很高的毒性，對藻類生長產(chǎn)生不良影響。由圖4可知，隨著磺胺二甲嘧啶濃度的增加，紫球藻生物量均低于KOCK培養(yǎng)基。一般來說，磺胺二甲嘧啶可抑制水生細(xì)菌的繁殖，在抑菌方面表現(xiàn)出強(qiáng)大作用，而與細(xì)菌相比，微藻對抗生素具有更強(qiáng)的耐受性[31]。不同濃度磺胺二甲嘧啶會干擾藻類的健康生長，導(dǎo)致其增殖劣于正常條件下生長的藻類，產(chǎn)量下降，功能缺失。而過高濃度磺胺二甲嘧啶可以通過殺死藻類營養(yǎng)生長所需的微生物，從而改變藻細(xì)胞的功能成分，進(jìn)而影響沼液廢水的資源化[32]。

由于微藻具有特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與特性，對沼液廢水中金屬元素和抗生素具有富集(或吸附)效果，藻細(xì)胞與金屬離子和抗生素結(jié)合的可能位置見圖5。

A為抗生素，M為重金屬。

抗生素和金屬通過吸附在細(xì)胞表面而富集，或通過胞質(zhì)配體、金屬硫蛋白等胞內(nèi)分子結(jié)合[33]。不同抗生素主導(dǎo)的吸附機(jī)制也不盡相同，沼液廢水中金屬離子和抗生素的去除主要通過吸附作用和生物降解，利用了抗生素的脂肪族和芳香族基團(tuán)與微藻(微生物)的親脂性細(xì)胞膜或污泥脂質(zhì)部分的疏水分配作用，帶電的化合物基團(tuán)與微生物及惰性顆粒表面還會發(fā)生靜電作用[34]，吸附作用會受到物質(zhì)自身親脂性和靜電作用的影響。藻細(xì)胞吸附重金屬是一個復(fù)雜的物化與生化過程，藻細(xì)胞富集重金屬主要包括生物吸附和生物富集兩個機(jī)制(圖5)[35]。藻細(xì)胞對抗生素和重金屬的選擇性吸附與吸附效率主要由細(xì)胞壁性質(zhì)決定，通過細(xì)胞壁上的多糖、蛋白質(zhì)、脂類等具有的羥基、羧基、氨基、酰胺基等帶負(fù)電荷的官能團(tuán)與金屬陽離子靜電結(jié)合或絡(luò)合而起作用[36]。藻細(xì)胞內(nèi)存在金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)，胞內(nèi)結(jié)合通常與藻細(xì)胞的解毒機(jī)制有關(guān)，如藻細(xì)胞在重金屬環(huán)境中可以誘導(dǎo)產(chǎn)生類金屬硫蛋白來束縛金屬，從而達(dá)到富集重金屬的目的[37]。

紫球藻的生長受多種因素影響，所以利用培養(yǎng)的藻類處理養(yǎng)豬沼液的研究需要考慮眾多因素的影響。筆者研究側(cè)重于利用培養(yǎng)的微藻來處理養(yǎng)豬沼液，尤其是通過富含多糖、蛋白質(zhì)或油脂等高價值組分的藻類來處理廢水中氨氮，以及難處理的重金屬、抗生素等物質(zhì)，不僅可以降低微藻培養(yǎng)成本，還有望緩解由養(yǎng)豬沼液造成的環(huán)境問題，為微藻培養(yǎng)-廢水處理資源化利用提供新的可能方向。

4 結(jié)論

(1)高濃度氨氮和Cu2+都會影響紫球藻細(xì)胞的生長，但是在培養(yǎng)液中一定濃度的氨氮和Cu2+對紫球藻生長影響不大，利用富含胞外多糖的紫球藻處理養(yǎng)豬沼液廢水具有一定效果。

(2)不同濃度磺胺二甲嘧啶對紫球藻的生長影響不同，一定低濃度的磺胺二甲嘧啶對紫球藻生長影響不大，而高濃度抗生素對紫球藻的生長起抑制作用，并且濃度越高，抑制效果越明顯。

(3)在最佳氨氮、Cu2+和抗生素磺胺二甲嘧啶濃度條件下紫球藻對各污染物去除率的測定結(jié)果表明，對氨氮去除效率為73.2%，對Cu2+去除效率為54.3%，對磺胺二甲嘧啶去除效率為56.9%。經(jīng)去除后，各物質(zhì)含量均有大幅下降，微藻培養(yǎng)可以作為沼液廢水中各污染物處理的一個有效環(huán)節(jié)。