消癖顆粒聯(lián)合他莫昔芬對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、克隆、凋亡及細(xì)胞內(nèi)DNA損傷程度的影響

韋任雄， 張玉柱， 陳前軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)院乳腺外科，廣東廣州 510120）

乳腺癌是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。目前，手術(shù)和藥物治療仍然是乳腺癌的兩大治療手段，在乳腺癌人群中約70%的患者屬于雌激素受體（ER）陽性乳腺癌，因此可受益于內(nèi)分泌治療。他莫昔芬作為絕經(jīng)前乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的常用藥物之一，其主要作用機(jī)制被認(rèn)為是通過競爭性結(jié)合抑制ER形成穩(wěn)定復(fù)合物，在核內(nèi)有效地阻滯了DNA 的復(fù)制，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。研究[2]表明，他莫昔芬在治療以及預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)的同時，20%～30%的患者會出現(xiàn)耐藥性，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。他莫昔芬耐藥已經(jīng)成為臨床上面臨的主要難題，它標(biāo)志著內(nèi)分泌治療的失敗。近年來許多研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬聯(lián)合中藥治療可以有效提高他莫昔芬治療的敏感性、降低副作用，預(yù)示了乳腺癌中西醫(yī)結(jié)合治療模式的臨床應(yīng)用前景。

消癖顆粒是國家名老中醫(yī)林毅教授研制的中藥復(fù)方制劑（在原消癖口服液系列制劑基礎(chǔ)上組方優(yōu)化而成），具有調(diào)攝沖任、疏肝解郁之功。既往消癖顆粒的臨床Ⅰ期和Ⅱ期試驗研究表明，其能有效縮小乳腺增生腫塊、降低腫塊密度、改善乳腺增生病的不良結(jié)構(gòu)、緩解疼痛以及減輕伴隨癥狀[6]，具有良好的治療效果，且無毒副反應(yīng)[7]。前期研究表明：消癖顆粒主要通過系統(tǒng)調(diào)節(jié)，尤其是對于腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)對乳腺中到重度不典型增生起阻斷及逆轉(zhuǎn)作用[8-10]，并具有抗癌活性；其對乳腺癌細(xì)胞MDA-231及MCF-7增殖生長具有抑制作用，并對乳腺腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移具有潛在療效[10]。本研究選用ER+、孕激素受體（PR）+的人源乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D作為研究對象，擬探討消癖顆粒對其體外生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步分析消癖顆粒對他莫昔芬耐藥的影響及其潛在機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人源ER+、PR+乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和T47D 由中山大學(xué)孫逸仙醫(yī)院乳腺癌研究團(tuán)隊惠贈，以含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中，用2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2 試劑細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶均購自北京邁晨科技有限公司；胎牛血清購自美國Invitrogen 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性試劑盒（南京建成生物公司）；8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）檢測試劑盒（USCN 公司）；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒（美國Thermo公司）；原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）標(biāo)記法（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京建成生物公司）。

1.3 儀器CKX41型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；VICTOR X5 型酶標(biāo)儀（美國Bio Tek 公司）；KQ-100DE型數(shù)控浴式超聲儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；1-15K 冷凍臺式離心機(jī)（德國Sigma 公司）；FACS VantageTM流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.4 藥物及制備消癖顆粒（專利號：ZL200510034765.8）由奇績醫(yī)藥公司提供，包括淫羊藿、肉蓯蓉、郁金、丹參、莪術(shù)、益母草、女貞子、制何首烏、鱉甲、牡蠣等中藥成分。將消癖顆粒研磨成粉末，稱取1 g 粉末溶解于20 mL 無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基中（配成濃度50 mg/mL貯存液），水浴鍋60 ℃超聲浸泡80 min，共3 次。再經(jīng)12 000 r/min 離心15 min 后，在無菌條件下用濾膜過濾備用。他莫昔芬購自揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：08022501。稱取5 mg 他莫昔芬粉末溶于1.345 8 mL 二甲基亞砜（DMSO）配成10 mmol/L貯存液于-20 ℃避光保存。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖能力 將對數(shù)生長期的MCF-7和T47D細(xì)胞，用胰蛋白酶溶液消化后吹打均勻并調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個/mL的細(xì)胞懸液，用排槍接種到96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后，用RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋他莫昔芬貯存液加入96 孔板使終濃度為0、1、10、100、500 μmol/L，同樣方法，加入消癖顆粒溶液使終濃度為200、400、600、800、1 000 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。計算每組設(shè)6個復(fù)孔，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔分別加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm 波長處測定吸光度（OD，D）值。取各復(fù)孔D（570 nm）值的平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。不同濃度的消癖顆粒和他莫昔芬作用下的細(xì)胞生存率，細(xì)胞生存率= 實驗組OD 均值/空白對照組OD 均值× 100%。根據(jù)單藥對細(xì)胞生長抑制率檢測結(jié)果，最后選擇10 μmol/L 濃度的他莫昔芬以消癖顆粒（MCF-7：800 μg/mL；T47D：600 μg/mL）聯(lián)合應(yīng)用，再觀察聯(lián)合用藥對MCF-7和T47D細(xì)胞增殖的抑制作用?？瞻捉M：僅加0.1%DMSO。消癖顆粒組：MCF-7 細(xì)胞，加消癖顆粒800 μg/mL；T47D 細(xì)胞，加消癖顆粒 600 μg/mL。他莫昔芬組：加10 μmol/L 他莫昔芬。聯(lián)合用藥組：MCF-7細(xì)胞，加消癖顆粒800 μg/mL、他莫昔芬10 μmol/L；T47D 細(xì)胞，加消癖顆粒600 μg/mL、他莫昔芬10 μmol/L。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測細(xì)胞上清液LDH含量[11]和細(xì)胞8-OHdG含量 取對數(shù)生長期的MCF-7或T47D 細(xì)胞，接種于6孔板，按設(shè)定的不同處理組別加入藥物，處理24 h。收集上清，以1 500 r/min 離心5 min，按照試劑盒說明書進(jìn)行樣品測定，用酶標(biāo)儀測定D（450 nm）值。收集細(xì)胞，用二喹啉甲酸（BCA）法測定細(xì)胞樣本中的蛋白含量，采用ELISA 法測定8-OHdG 含量，用酶標(biāo)儀檢測D（450 nm）值，具體步驟和計算公式均按試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.5.3 球囊形成實驗 取處于對數(shù)生長期的MCF-7或T47D 細(xì)胞，以每孔 2 × 104個/mL，接種到6 孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后按照上述分組給予不同的藥物，觀察細(xì)胞球形成過程，拍照并記錄。

1.5.4 Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）雙染色法測定細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期MCF-7或T47D細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸。將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用不同處理組含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。使用無EDTA 胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，以1 500 r/min 離心10 min去上清。使用2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)胞，再次以1 500 r/min 離心10 min 去上清。重復(fù)本步驟1 次后去除PBS。加入400 μL 的 Binding buffer 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分為2 管，每管200 mL，其中一管設(shè)為空白對照，另一管為處理組繼續(xù)加入試劑進(jìn)行處理。處理組加入5 μL AnnexinVFITC混勻后，再加入5 μL PI混勻后室溫下避光孵育15 min。孵育完畢后于1 h 內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.5 TUNEL 法測定細(xì)胞凋亡 用40 g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞，避光條件下，按9∶1 混勻TUNEL 試劑盒中的A 液和B 液，加入配制好的TUNEL 反應(yīng)液，加入待檢測細(xì)胞爬片中，放入37 ℃恒溫孵育1 h。PBS 清洗后封片，Hoechst 染料染細(xì)胞核5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算凋亡率。凋亡率= TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/Hoechst 細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.6 劃痕實驗 以直尺比著在6 孔板背后劃橫線，將MCF-7或T47D 細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)100%時，用200 μL tip 槍頭用力均勻垂直地在培養(yǎng)孔中劃痕后，PBS清洗3次，去除脫落細(xì)胞。按照上述不同分組，加入不同的含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞。于0 h 和48 h 分別在相同位置拍照，比較各組劃痕寬度。

1.5.7 平板克隆實驗 將MCF-7 或T47D 細(xì)胞調(diào)整濃度為500 個/mL，以1 000 個/孔的細(xì)胞密度分別接種到6 孔板中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。不同實驗組加入對應(yīng)的含藥培養(yǎng)基。孵育2周后取出培養(yǎng)板，期間每3 d 更換1 次培養(yǎng)液。用PBS 清洗3 次。再用40 g/L 多聚甲醛固定20 min。然后吸去固定液，加適量0.02%結(jié)晶紫染色液染色30 min。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞集落。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個樣本間均數(shù)比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消癖顆粒、他莫昔芬對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D 生長的影響圖1 結(jié)果顯示，他莫昔芬能夠抑制MCF-7和T47D細(xì)胞的增殖作用，且呈濃度依賴性。他莫昔芬抑制MCF-7 和T47D 細(xì)胞增殖的IC50分別為12 μmol/L 和 10 μmol/L，各組間細(xì)胞增殖抑制率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

將消癖顆粒聯(lián)合他莫昔芬（10 μmol/L）干預(yù)細(xì)胞。從圖2結(jié)果可知，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率優(yōu)于消癖顆粒單藥組，各組間細(xì)胞增殖抑制率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。消癖顆粒聯(lián)合用藥的最佳濃度中：MCF-7，800 μg/mL；T47D，600 μg/mL。消癖顆粒組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組24 h 的細(xì)胞存活率較空白組明顯降低（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率低于他莫昔芬組和消癖顆粒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），消癖顆粒組和他莫昔芬組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示消癖顆粒與他莫昔芬聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于消癖顆粒或他莫昔芬單用。

圖1 他莫昔芬對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D存活率的影響（±s，n=3）Figure 1 Effect of Tamoxifen on the survival rate of breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

圖2 消癖顆粒聯(lián)合他莫昔芬對MCF-7和T47D細(xì)胞存活率的影響（±s，n=3）Figure 2 Effect of Xiaopi Granules combined with Tamoxifen on the survival rate of breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

LDH實驗（圖3）結(jié)果顯示：消癖顆粒組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組LDH 釋放量較空白組增多（P＜0.05），其中以聯(lián)合用藥組最為顯著。

上述結(jié)果綜合提示，消癖顆粒對乳腺癌細(xì)胞（MCF-7：800 μg/mL；T47D：600 μg/mL）增殖有顯著抑制作用，并且可以加強他莫昔芬對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果。

2.2 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D中8-OHdG含量的影響圖4結(jié)果顯示：與空白組比較，消癖顆粒組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)8-OHdG 的含量均明顯升高（P＜0.05），分別上升至空白組的2.40 倍、2.80 倍和3.60 倍。表明消癖顆粒和他莫昔芬均能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D中8-OHdG的含量增加，增加氧化損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且消癖顆粒能增強他莫昔芬誘導(dǎo)氧化損傷的作用。

圖3 消癖顆粒聯(lián)合他莫昔芬對MCF-7和T47D 細(xì)胞LDH釋放的影響（±s，n=3）Figure 3 Effect of Xiaopi Granules combined with Tamoxifen on LDH release in breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

圖4 消癖顆粒、他莫西芬單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7和T47D 細(xì)胞內(nèi)8-OHdG表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 4 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on expression of 8-OHdG in breast cancer cells MCF-7 and T47D（±s，n=3）

2.3 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞球囊形成的影響乳腺癌細(xì)胞MCF-7 或T47D 在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后，可見少部分細(xì)胞貼壁，大部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，并見少量腫瘤細(xì)胞球形成，懸浮生長，細(xì)胞數(shù)目5～9 個不等，細(xì)胞間連接緊密。繼續(xù)培養(yǎng)觀察，細(xì)胞球逐漸增大。培養(yǎng)5～7 d 后可觀察到數(shù)十個細(xì)胞組成的細(xì)胞球，呈橢圓形或類圓形。圖5、6 顯示，培養(yǎng)8 d后在鏡下，各組球囊的大小不一，聯(lián)合用藥組最小，消癖顆粒組和他莫昔芬組次之且大小相仿，空白組最大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明消癖顆粒和他莫昔芬均能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，且消癖顆粒能增強他莫昔芬抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。

2.4 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和T47D 凋亡功能的影響圖7 結(jié)果顯示，消癖顆粒組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組綠光熒光強度較空白組明顯增強，且聯(lián)合用藥組綠光熒光較其他3組明顯增加。圖8結(jié)果顯示，空白組、消癖顆粒組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組晚期凋亡率 MCF-7 分別 為：（2.07 ± 0.912）%、（9.27 ±2.422）%、（14.2 ± 3.866）%、（27.3 ± 5.224）%；T47D分別為：（1.44±0.844）%、（6.42±2.561）%、（9.28±4.464）%、（19.3±5.024）%。與空白組比較，其他3組細(xì)胞凋亡率增加，且聯(lián)合用藥較單藥治療能更顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示消癖顆?？梢詤f(xié)同他莫昔芬誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

圖5 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7和T47D 細(xì)胞培養(yǎng)8 d后球囊形成情況的影響（球囊形成實驗，×200）Figure 5 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on balloon formation of breast cancer cells MCF-7 and T47D after 8-day culture（balloon formation assay，× 200）

圖6 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7和T47D 細(xì)胞球囊形成球徑的影響（±s，n=3）Figure 6 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on size of spheroids of MCF-7 and T47D cells（±s，n=3）

2.5 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和T47D 遷移能力的影響圖9 結(jié)果顯示，相同的劃痕實驗檢測時間點，空白組的劃痕空間隨著細(xì)胞的生長距離逐漸變短，而消癖顆粒組、他莫昔芬組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞向劃痕空間的生長速度顯著低于空白組，距離相較于空白組稍寬（P＜0.05），其中，聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移能力明顯減弱（P＜0.05）。上述實驗結(jié)果表明，消癖顆粒對乳腺癌MCF-7和T47D細(xì)胞的遷移侵襲能力有顯著影響，并且可以顯著提高他莫昔芬對乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制作用。

圖7 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D凋亡功能的影響（TUNEL法，×200）Figure 7 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on apoptosis function of MCF-7 and T47D cells（by TUNEL assay，× 200）

2.6 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和T47D 克隆能力的影響圖10 結(jié)果顯示，空白組MCF-7和T47D的細(xì)胞克隆形成率最高，消癖顆粒組和他莫昔芬組次之，聯(lián)合用藥組最少，且與空白組比較，其他3組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明消癖顆粒對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D的克隆形成能力有顯著影響，并且可以顯著提高他莫昔芬對乳腺癌細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用。

圖8 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D凋亡功能的影響（流式細(xì)胞術(shù)）Figure 8 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on apoptosis function of MCF-7 and T47D cells（by flow cytometry）

圖9 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7和T47D細(xì)胞遷移能力的影響（劃痕愈合實驗）Figure 9 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on migration of MCF-7 and T47D cells（by scratch assay）

圖10 消癖顆粒、他莫昔芬單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7和T47D細(xì)胞克隆能力的影響（克隆形成實驗）Figure 10 Effect of Xiaopi Granules，Tamoxifen alone or combination on clone ability of MCF-7 and T47D cells（by clone assay）

3 討論

由于乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤，癌細(xì)胞的生長受體內(nèi)多種激素的調(diào)控，其中，雌激素在大部分乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。目前，他莫昔芬是內(nèi)分泌治療最常用的治療藥物之一，長期使用他莫昔芬后會引起諸多不良反應(yīng)，如子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險、潮熱多汗等，干擾了乳腺癌治療的連續(xù)性，影響患者的生存期[12-13]。而他莫昔芬的耐藥性導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，是目前臨床治療亟待解決的難題，嚴(yán)重影響了患者的生存及預(yù)后[14]。有研究表明，他莫昔芬耐藥的機(jī)制可能與分子通路[15]、藥物代謝酶CYP2D6基因多態(tài)性[16-17]、G 蛋白偶聯(lián)ER[18-19]等有關(guān)。在這些機(jī)制研究中可以發(fā)現(xiàn)，耐藥性癌細(xì)胞中活性氧簇（ROS）維持在較低水平[20]，此外，BARD1 和BRCA1 在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，增強了癌細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)能力和對DNA 破壞性化療的耐藥性[21]。而他莫昔芬主要通過提高ROS 水平造成DNA 氧化損傷[22]，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。因此，誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA 損傷，以提高耐藥性癌細(xì)胞對藥物的敏感性，為克服癌癥耐藥提供了新思路[23]。

乳腺癌在祖國醫(yī)學(xué)體系屬“乳巖”“乳石癰”等范疇。其發(fā)生主要是由于正氣內(nèi)虛、肝腎不足、沖任失調(diào)，加之七情所傷，臟腑失和，六淫邪毒乘隙內(nèi)侵，內(nèi)外合邪，致使經(jīng)絡(luò)受阻，氣滯血瘀，痰凝毒聚而形成。乳腺癌的發(fā)生與諸多臟腑功能失調(diào)、痰瘀等病理產(chǎn)物以及沖任失調(diào)有關(guān)。其中，內(nèi)分泌的紊亂與中醫(yī)沖任失調(diào)關(guān)系最為密切。

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)消癖顆?？梢砸种艵R+、PR+乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和T47D 的增殖，并且其抑制作用隨濃度的增高而增強，具有劑量依賴性。消癖顆粒和他莫昔芬聯(lián)合使用可使MCF-7和T47D細(xì)胞存活率明顯下降。為了進(jìn)一步驗證聯(lián)合用藥的效果，我們采用了多種方法對細(xì)胞進(jìn)行檢測。首先從表型進(jìn)行驗證，通過劃痕實驗和平板克隆實驗以及球囊形成實驗，結(jié)果顯示各組對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D的增殖、遷移以及抗凋亡功能的抑制能力順序為：空白組＜消癖顆粒組＜他莫昔芬組＜聯(lián)合用藥組。進(jìn)一步TUNEL 法和定量的Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測結(jié)果均驗證聯(lián)合用藥可明顯增強乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和T47D的凋亡。8-OHdG 是敏感的DNA 損害生物指標(biāo)，是最能反映機(jī)體內(nèi)DNA 氧化損傷程度的標(biāo)志物。他莫昔芬介導(dǎo)的DNA 氧化損傷是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[24-26]。消癖顆粒可促進(jìn)MCF-7 和T47D 細(xì)胞中8-OHdG 生成增多，且聯(lián)合他莫昔芬使用時其促進(jìn)作用更為顯著。

綜上所述，消癖顆粒聯(lián)合他莫昔芬可以協(xié)同發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞增殖抑制和促凋亡的作用。消癖顆粒作為已上市中成藥，其安全性及毒副作用有所保障。目前消癖顆粒的具體作用機(jī)制尚未清楚，還需在進(jìn)一步的研究中深入探討，以為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。