響應(yīng)面優(yōu)化羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)血根堿的包合工藝

梁 浩,錢璽丞,杜曉靜,郁建生

(銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院中獸藥重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,貴州銅仁 554300)

血根堿(sanguinarine)是一種苯并菲啶型生物堿,主要存在于白屈菜和博落回的全草、紫堇的根、塊之中以及血水草的地上部分[1-7]。研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、改善肝功能等多種藥理活性[8-11],廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、獸藥和飼料添加劑以及生物農(nóng)藥之中[12-17],且血根堿可有效清除自由基保護(hù)生物大分子的氧化和羰基化損傷,具有作為天然食品抗氧化劑的潛力[18]。但因其自身理化性質(zhì)的缺陷,如穩(wěn)定性較差和水溶性低等因素限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍[19]。

環(huán)糊精包合技術(shù)具有提高難溶性藥物溶解度增加其穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[20],羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)是β-環(huán)糊精的羥丙基衍生物,與其母體β-環(huán)糊精相比,水溶性更好,在人體中耐受性好,無(wú)腎毒性,是一種適用性較廣的低毒、安全、有效的藥物增溶劑,目前其正在逐步代替其母體,廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域[21]。

目前關(guān)于羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)苯并菲啶型生物堿的包合作用研究較少,主要集中在對(duì)小檗堿的包合作用及包合物性質(zhì)的研究,對(duì)血根堿的包合作用尚未有人報(bào)道[22-24]。因此,本試驗(yàn)以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料,將血根堿制成羥丙基-β-環(huán)糊精包合物,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化血根堿包合物的制備工藝,以期增加血根堿的溶解度和穩(wěn)定性,為進(jìn)一步拓寬血根堿的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血根堿 參考文獻(xiàn)[25]自制,經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為95.1%;血根堿標(biāo)品(HPLC≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;羥丙基-β-環(huán)糊精(純度99%) 上海源葉生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸等 均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥試劑。

Agilent1290超高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;T10CS紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;CP323C千分之一分析天平 奧豪斯儀器有限公司;CPA225D十萬(wàn)分之一分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;DF-101S數(shù)顯恒溫集熱式磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;FZG-1真空干燥箱 南京華莎干燥設(shè)備有限公司;DHG-9030A鼓風(fēng)干燥箱 上?；厶﹥x器制造有限公司;SG5200HE超聲波清洗機(jī) 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備 稱取一定量的羥丙基-β-環(huán)糊精加入5 mL蒸餾水中,在一定溫度下水浴加熱,加入血根堿0.1 g,避光水浴攪拌一定時(shí)間,之后于40 ℃真空干燥,即得包合物。

1.2.2 血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 羥丙基-β-環(huán)糊精與血根堿配比對(duì)包合率的影響 在包合時(shí)間1 h,包合溫度60 ℃的條件下,研究羥丙基-β-環(huán)糊精與血根堿不同包合比(1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 g∶g)對(duì)血根堿包合率的影響。

1.2.2.2 包合溫度對(duì)血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合的影響 在包合比10∶1,包合時(shí)間1 h的條件下,研究不同包合溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對(duì)血根堿包合率的影響。

1.2.2.3 包合時(shí)間對(duì)血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合的影響 在包合比10∶1,包合溫度60 ℃的條件下,研究不同包合時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)對(duì)血根堿包合率的影響。

1.2.3 血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合試驗(yàn)的響應(yīng)面分析 以血根堿包合率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精配比(X1)、包合溫度(X2)和包合時(shí)間(X3)3個(gè)因素,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面(RSM)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.4 血根堿含量測(cè)定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取10.65 mg血根堿對(duì)照品置于100 mL容量瓶,用甲醇-1.0%鹽酸溶液(50∶50)溶解,并稀釋定容,得血根堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取血根堿標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于50 mL容量瓶中,加甲醇-1.0%鹽酸溶液(50∶50)定容,進(jìn)行色譜檢測(cè)。以峰面積Y為縱坐標(biāo),濃度X為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=-3.6454+13.9661X,R2=0.99994,在 0～42.6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.2 色譜條件 檢測(cè)波長(zhǎng) 271 nm;C18色譜柱;進(jìn)樣量 2 μL;流速 0.5 mL/min;0.1%磷酸-乙腈作為流動(dòng)相;柱溫 25 ℃。

1.2.4.3 樣品測(cè)定及包合率計(jì)算 按單因素試驗(yàn)方案和響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案制備血根堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物,稱量包合物約10 mg,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加1.0%鹽酸-甲醇溶液(50∶50)超聲溶解,稀釋定容,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,制得供試樣品溶液。在波長(zhǎng)為271 nm條件下采用高效液相色譜法測(cè)定,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到血根堿含量。血根堿包合率(%)=(加入血根堿總質(zhì)量-包合物中游離血根堿質(zhì)量)/加入血根堿總質(zhì)量×100

1.2.5 血根堿包合物的驗(yàn)證 分別配制相同濃度(6 μg/mL)的血根堿溶液、血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精混合物溶液、血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合物溶液、羥丙基-β-環(huán)糊精溶液,分別掃描在200～400 nm之間的紫外光譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次結(jié)果采用Origin Pro 8.0 軟件進(jìn)行處理,采用Design-Expert 8.0.6.1對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 羥丙基-β-環(huán)糊精與血根堿配比對(duì)包合率的影響 通過包合比對(duì)包合率影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析得P=0.0049達(dá)到極顯著水平(P<0.01),由圖1可知,隨著羥丙基-β-環(huán)糊精與血根堿包合比的增大包合率隨之增大,但到10∶1時(shí)血根堿的包合率達(dá)到46.5%,之后血根堿包合率隨包合比的繼續(xù)增大,包合率增大不明顯,其原因是包合比較小時(shí)羥丙基-β-環(huán)糊精過少,不足以包合所有的血根堿,當(dāng)達(dá)到10∶1時(shí),羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)血根堿的包合以達(dá)到飽和,因此繼續(xù)增加羥丙基-β-環(huán)糊精的用量包合率增大不明顯,從經(jīng)濟(jì)方面考慮,選擇羥丙基-β-環(huán)糊精與血根堿配比為10∶1。

圖1 包合比對(duì)包合率的影響Fig.1 Effect of inclusion ratio on inclusion rate

2.1.2 包合溫度對(duì)血根堿包合率的影響 通過包合溫度對(duì)包合率影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析得P=0.0059達(dá)到極顯著水平(P<0.01),由圖2可知,隨溫度的上升包合率不斷增大,當(dāng)上升到60 ℃時(shí),包合率達(dá)到最大值為46.5%,之后隨溫度的繼續(xù)升高包合率開始下降,可能是由于包合過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程,溫度較低分子運(yùn)動(dòng)緩慢不利于客體分子進(jìn)入主體分子,溫度過高由于分子運(yùn)動(dòng)加劇,導(dǎo)致包合物分解[26]。因此選擇60 ℃為較佳溫度。

圖2 包合溫度對(duì)包合率的影響Fig.2 Effect of inclusion temperature on inclusion rate

2.1.3 包合時(shí)間對(duì)血根堿包合率的影響 通過包合時(shí)間對(duì)包合率影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析得P=2.22×10-5達(dá)到極顯著水平(P<0.01),由圖3可知,隨著包合時(shí)間的增加,血根堿包合率增大,當(dāng)包合時(shí)間3 h時(shí)血根堿包合率達(dá)到最大值為73.20%,縮短或延長(zhǎng)包合時(shí)間血根堿包合率均會(huì)下降,可能是由于包合過程是客體分子進(jìn)入主體分子并形成氫鍵的動(dòng)態(tài)過程,時(shí)間縮短包合過程尚未完成,時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)包合的包合物脫離包合[26]。因此選擇3 h為較佳包合時(shí)間。

圖3 包合時(shí)間對(duì)包合率的影響Fig.3 Effect of inclusion time on inclusion rate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results

從表3 可知,血根堿工藝參數(shù)回歸模型的P值=0.0005達(dá)到極顯著水平(P<0.01),且失擬項(xiàng)P值=0.2030(P>0.05),不顯著,方程決定系數(shù)R2=0.9584,說明回歸方程的擬合度較好,預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性,可用于血根堿包合反應(yīng)的分析與預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明,3個(gè)影響因素對(duì)血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合影響的大小順序依次為:包合時(shí)間(X3)>包合比(X1)>包合溫度(X2)。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 包合工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 圖4為包合工藝的各因素兩兩交互作用對(duì)血根堿包合反應(yīng)影響的3D響應(yīng)曲面圖。由圖4可看出,包合溫度與包合時(shí)間的兩因素交互作用不顯著,包合比與包合溫度、包合比與包合時(shí)間的兩因素交互作用顯著。根據(jù)響應(yīng)面分析得到的較佳工藝參數(shù):包合比10.26∶1,包合溫度為60.16 ℃,包合時(shí)間為3.15 h。在此條件下,血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合率的理論預(yù)測(cè)值為72.43%。

圖4 兩因素交互作用對(duì)包合率的影響Fig.4 Each two factors interact on the inclusion rate of response surface map

2.2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 考慮到實(shí)際操作的局限性,故將實(shí)際提取工藝條件修正為包合比10∶1,包合溫度為60 ℃,包合時(shí)間為190 min,在修正條件下進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),血根堿包合率平均值達(dá)到73.55%,與理論值相對(duì)誤差為1.5%。由此可見,響應(yīng)面分析的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際值較吻合,說明采用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的血血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的驗(yàn)證

利用紫外光譜法[27]對(duì)血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的形成進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如圖5所示。

圖5 血根堿、羥丙基-β-環(huán)糊精、兩者混合物及其包合物的紫外光譜Fig.5 Ultraviolet spectrum of sanguinarine,β-cyclodextrin,mixtures of the two and their inclusions

不同物質(zhì)的紫外吸收曲線以及吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異,如圖5所示,從圖中可以看到,血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的紫外吸收曲線波峰位于324 nm以及269.5 nm,血根堿和血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精混合物的波峰位于329 nm和275 nm,因此可判定得到的物質(zhì)并不是血根堿與羥丙基-β-環(huán)糊精的簡(jiǎn)單混合物,而是血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。

3 結(jié)論

本研究采用溶液攪拌法制備血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物,并通過響應(yīng)面法對(duì)包合工藝進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物最佳制備工藝為:羥丙基-β-環(huán)糊精和血根堿配比為10∶1,包合溫度為60 ℃,包合時(shí)間為190 min,包合率達(dá)到73.55%。經(jīng)紫外光譜驗(yàn)證,血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物已經(jīng)形成,本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化出的血根堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的最佳制備工藝穩(wěn)定、可靠,為血根堿新制劑的研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。