過(guò)表達(dá)本氏煙基因NbPAP2對(duì)轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響

代庭偉，呂雪艷，陳 放，徐 鶯

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 教育部生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065)

1 引 言

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的重要元素之一.作為核糖核酸和脫氧核糖核酸的重要組成部分，磷不僅影響細(xì)胞的分裂和分化，同時(shí)還參與光合作用過(guò)程中蔗糖的生物合成，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，有利于種子的養(yǎng)分積累[1].酸性磷酸酶(APase)是酸性條件下(pH<7.0)能催化磷酸單酯或酸酐裂解從而釋放無(wú)機(jī)磷酸根離子的水解酶類[2].其中的紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatase，PAP)因其酶提取液呈紫色或粉色而得名.PAP除具有酸性磷酸酶都有的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和雙金屬離子催化中心外，其活性還不受酒石酸鹽抑制[3-4].研究顯示紫色酸性磷酸酶在植物應(yīng)答低磷脅迫時(shí)，通過(guò)其水解磷化合物的能力來(lái)調(diào)節(jié)磷的獲取和再分配[5].此外，一些PAPs除了參與磷代謝外，還具有其他的生物學(xué)功能.例如大豆GmPAP3[6]和擬南芥AtPAP17[7]具有過(guò)氧化物酶活性.煙草NtPAP12可以使載脂蛋白的磷酸化殘基去磷酸化，可能參與細(xì)胞壁再生過(guò)程[8].通過(guò)C端疏水基序同時(shí)靶向葉綠體和線粒體的擬南芥AtPAP2則是參與植物的碳代謝過(guò)程，有報(bào)道指出，過(guò)表達(dá)AtPAP2的擬南芥蔗糖磷酸合成酶SPS活性和蔗糖含量均提高，生長(zhǎng)發(fā)育加速并且種子產(chǎn)量增高[9].

茄科(Solanaceae)植物廣泛分布于熱帶及溫帶地區(qū)，其中有多種重要的蔬菜、經(jīng)濟(jì)、觀賞和藥用植物，如馬鈴薯、番茄、辣椒、茄子、枸杞、煙草、天仙子、碧冬茄等.產(chǎn)量或生物量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上衡量茄科植物的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一，因此對(duì)于茄科植物磷元素吸收及利用機(jī)制的研究具有重要意義.本氏煙(Nicotianabenthamiana)是茄科植物的一員，也是常見(jiàn)的模式植物，對(duì)其磷利用機(jī)制的研究有助于茄科植物的品種改良.因此本文利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及生理學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)AtPAP2同源基因NbPAP2功能的初步研究，了解其在蔗糖代謝和增加植物產(chǎn)量相關(guān)途徑中可能發(fā)揮的作用，為茄科植物產(chǎn)量的增加提供新的思路和方法.

2 材料和方法

2.1 材 料

2.1.1 植物材料 本氏煙(Nicotianabenthamiana)由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物發(fā)育與生殖實(shí)驗(yàn)室保存.

2.1.2 PCR引物 見(jiàn)表1.

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for PCR assays

2.2 方 法

2.2.1NbPAP2基因的克隆 以擬南芥AtPAP2基因序列為模板，在本氏煙基因組Nicotianabenthamianadraft genome sequence v1.0.1數(shù)據(jù)庫(kù)(https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_benthamiana/genome)中進(jìn)行序列比對(duì)，選擇同源性最高的基因序列，根據(jù)所得基因序列設(shè)計(jì)引物NbPAP2-F和NbPAP2-R(表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得.

2.2.2 生物信息學(xué)分析 序列同源性比較采用BLASTn/BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi)和CLC sequence Viewer6 (本地)；信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP 4.1 Server(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；疏水性預(yù)測(cè)采用ExPASy-ProtScale(https:// web. expasy.org/protscale/)；亞細(xì)胞定位采用PredictProtein(https://www. predictprotein.org/).

2.2.3 熒光定量PCR分析 利用RNAPrep Pure Plant Kit試劑盒(天根)提取本氏煙各個(gè)不同組織：根、莖、幼葉、成熟葉、花瓣、花萼、幼果、成熟果的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒(Bio-Rad)在Bio-Rad IQ5 PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1.

2.2.4 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定 通過(guò)同源重組方法將NbPAP2基因插入pKSE-35S載體XbaⅠ和SacⅠ之間(圖1)，測(cè)序鑒定后導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，使用葉圓盤法轉(zhuǎn)化本氏煙葉片外植體，對(duì)獲得的卡納霉素抗性植株進(jìn)行PCR篩選，然后用q-PCR方法對(duì)PCR陽(yáng)性植株NbPAP2的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析.所用引物見(jiàn)表1.

圖1 重組載體pKSE-NbPAP2線性圖譜及引物位置Fig.1 Linear map of the recombinant vector pKSE-NbPAP2 and primer positions

2.2.5 光合速率和氣孔導(dǎo)度的測(cè)定 于上午8：30～11：00間，選取株齡90 d植株的完全展開(kāi)葉片，每一株系選取三株，每株選取三片，使用CIRAS-2便攜式光合/熒光測(cè)定系統(tǒng)(英國(guó)PP Systems公司)，分別測(cè)定光合有效輻射(Photosynthetically active radiation，PAR)為200、400、600、800、1000μmol/m2/s時(shí)的光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)的值，每個(gè)葉片測(cè)定三次.

2.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草蔗糖含量測(cè)定 蔗糖含量采用蒽酮比色法[10]測(cè)定新鮮成熟煙草葉片(避開(kāi)主葉脈).

2.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草SPS酶活性測(cè)定 蔗糖磷酸合成酶SPS的活性采用間二苯酚法測(cè)定[11].

3 結(jié)果與分析

3.1 本氏煙紫色酸性磷酸酶家族成員NbPAP2主要在成熟組織表達(dá)

以擬南芥AtPAP2基因序列為模板，通過(guò)序列比對(duì)，在本氏煙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Nicotianabenthamianadraft genome sequence v1.0.1)中獲得與其同源性最高的同源基因序列信息(登錄號(hào)Niben101Scf04400g02005.1)，然后以本氏煙植株的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增得到該基因，命名為NbPAP2.NbPAP2基因開(kāi)放讀碼框全長(zhǎng)1959bp，推測(cè)的蛋白質(zhì)含652個(gè)氨基酸殘基.與普通煙草(Nicotianatabacum)、辣椒(Capsicumannuum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、番茄(Solanumlycopersicum)中同源基因(XM_016654955.1、XM_016717209.1、XM_006344186.2、XM_004237004.4)的核酸序列相似性分別達(dá)到96%、88%、87%、86%，而與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPAP2(NM_101256.3)核酸序列的相似性為68%，氨基酸序列同源性則為64.2%.SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)出NbPAP2在N端存在信號(hào)肽(圖2A)，在線ProtScale模塊預(yù)測(cè)出多肽鏈第622位氨基酸處疏水性最強(qiáng)(圖2B)，Protein Predict預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示NbPAP2蛋白可能定位于葉綠體(圖2C)，這與AtPAP2蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果一致從而或許與其他植物PAP蛋白存在差異.

為了了解NbPAP2是否屬于紫色磷酸酶家族成員，對(duì)本氏煙草、普通煙草、辣椒、馬鈴薯和擬南芥共五個(gè)PAP2成員和一個(gè)AtPAP9進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)它們都具有紫色酸性磷酸酶家族的特征基序，即由五個(gè)保守基序(DXG/ GDXXY/ GNH(D/E))/VXXH/GHXH)構(gòu)成的雙核金屬離子中心[12]，同時(shí)與金屬離子結(jié)合的七個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基也非常保守(圖1D).這似乎說(shuō)明茄科植物的PAP成員與十字花科的擬南芥PAP具有一定程度上相似的功能.

提取野生型本氏煙植株的根、莖、幼葉、成熟葉、幼果、成熟果、花萼以及花瓣等不同組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用qRT-PCR方法測(cè)定NbPAP2的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，NbPAP2在各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，其在花瓣中表達(dá)量最高，顯著高于其他生物組織.在葉片和莖中的表達(dá)量次之，在根和果實(shí)中表達(dá)量最低.除此之外，NbPAP2在成熟葉和成熟果中的表達(dá)量略高于幼葉和幼果 (圖1E).

3.2 NbPAP2過(guò)表達(dá)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和種子發(fā)育

為了探究過(guò)表達(dá)NbPAP2對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法獲得4個(gè)表達(dá)穩(wěn)定且表達(dá)量相對(duì)較高的轉(zhuǎn)基因株系(OE-1、OE-2、OE-3和OE-4)，對(duì)4個(gè)株系的T1代卡那霉素抗性植株的表型進(jìn)行觀察及統(tǒng)計(jì).觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速度較野生型明顯加快，株型更加高大，并且這些改變與NbPAP2的表達(dá)水平呈正相關(guān)性(圖3A、B).過(guò)表達(dá)NbPAP2還導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株花期提前(表2).在過(guò)表達(dá)株系OE-1和OE-2中NbPAP2的表達(dá)水平比野生型均高了10倍以上，花期比野生型植株提前了9～14 d.OE-3與OE-4株系中NbPAP2的表達(dá)水平分別是野生型的4到7倍，其花期改變就沒(méi)有前兩個(gè)株系顯著，與對(duì)照相比，差異僅為2～3 d.

圖2 NbPAP2的生物信息學(xué)分析和表達(dá)時(shí)空性分析Fig.2 Bioinformatics analysis and spatiotemporal expression profile of NbPAP2A.信號(hào)肽預(yù)測(cè)；B. 疏水性分析；C. 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；D. 氨基酸序列比對(duì)(矩形所標(biāo)注的為5個(gè)氨基酸保守基序；三角所標(biāo)注的為7個(gè)不變氨基酸殘基)；E. 組織表達(dá)特異性的定量PCR分析.A. Signal peptide prediction; B. hydrophobicity analysis; C. subcellular localization prediction; D. amino acid sequence alignment (5 amino acid conserved motifs marked by rectangle; 7 invariant amino acid residues marked by triangle); e. quantitative PCR analysis of tissue expression specificity.

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的表型Fig. 3 Phenotype of transgenic tobacco plantsA. 野生型(WT)和過(guò)表達(dá)(OE-1、OE-2)植株；B.NtPAP2在野生型(WT)和過(guò)表達(dá)(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4)植株中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；C. 野生型(WT)和過(guò)表達(dá)(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4)植株的種子；D. 野生型(WT)和過(guò)表達(dá)(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4)植株種子的質(zhì)量.A. Wild type (WT) and NbPAP2 over expression (OE-1，OE-2) plants; B. relative transcription level of NbPAP2in WT and over expression (OE-1，OE-2，OE-3，OE-4) plants; C. seeds of WT and over expression (OE-1，OE-2，OE-3，OE-4) plants; D. seed quality of WT and over expression (OE-1，OE-2，OE-3，OE-4) plants.

表2 野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的開(kāi)花時(shí)間Tab.2 Flowering time of wild type plants and transgenicplants

不僅如此，我們還觀察到，與野生型植株相比，OE-1、OE-2兩個(gè)過(guò)表達(dá)株系的種子更為飽滿，種子的寬度和長(zhǎng)度都有所增加，但其他兩個(gè)過(guò)表達(dá)株系種子變化不明顯(圖3C).進(jìn)一步測(cè)定各株系種子的百粒重(圖3D)，OE-1、OE-2兩個(gè)過(guò)表達(dá)株系的種子質(zhì)量顯著高于野生型種子，提高了約23%～25%(圖2D).盡管如此，野生型植株和轉(zhuǎn)基因株系每個(gè)果實(shí)中的種子數(shù)量沒(méi)有明顯變化.

3.3 NbPAP2過(guò)表達(dá)影響植物光合作用和碳代謝

選取完全展開(kāi)的成熟葉片測(cè)定光合速率和氣孔導(dǎo)度發(fā)現(xiàn).與野生型相比，OE-1和OE-2株系凈光合速率分別增強(qiáng)了26%和20%.其他兩個(gè)株系OE-3和OE-4，雖然凈光合速率改變的幅度較小，但其凈光合速率相較于野生型也增強(qiáng)了5%左右(圖4A).在光合植物的葉片中，氣孔導(dǎo)度與葉肉細(xì)胞對(duì)CO2的需求相一致[13]，氣孔導(dǎo)度越大，植物的凈光合速率就越大.測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系OE-1和OE-2的氣孔導(dǎo)度增加了33%和28%，OE-3和OE-4也有明顯增加(圖4B).與野生型植株相比，過(guò)表達(dá)NbPAP2煙草的氣孔導(dǎo)度與光合速率的變化具有一致性，同時(shí)也與基因表達(dá)水平有明顯的相關(guān)性.

圖4 過(guò)表達(dá)NbPAP2影響轉(zhuǎn)基因植物的光合作用和碳代謝Fig.4 Overexpression of NbPAP2 affects photosynthesis and carbon metabolism in transgenic plantsA.野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率；B.野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的氣孔導(dǎo)度；C.野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株葉片的蔗糖含量；D.野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株葉片SPS活性.A. Net photosynthetic rate of wild type plants and transgenic plants; B.stomatal conductance of wild type plants and transgenic plants; C. sucrose content of wild type plants and transgenic plants; D. SPS activity of wild type plants and transgenic plants.

糖和糖原代謝信號(hào)影響植物的源庫(kù)平衡和碳分配，也影響光合基因的轉(zhuǎn)錄[14].分析顯示所有過(guò)表達(dá)NbPAP2株系的蔗糖含量均低于野生型煙草的蔗糖含量.OE-1和OE-2過(guò)表達(dá)NbPAP2株系的差異更為顯著，蔗糖含量分別降低了25%和17%(圖4C).蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，它不可逆地催化F6P和UDPG合成S6P，從而促進(jìn)蔗糖的合成.為了了解導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株蔗糖水平下降的原因，我們進(jìn)一步測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片中的SPS活性.出乎意料的是，與野生型相比，過(guò)表達(dá)植株的SPS活性均有不同程度的增強(qiáng)，而且OE-1與OE-2株系與野生型的差異較其他兩個(gè)株系更為顯著，其SPS酶活性分別增強(qiáng)了30%和33%(圖4D).

4 討 論

功能多樣的紫色磷酸酶廣泛分布在各種生物中.與擬南芥AtPAP2相比，本氏煙NbPAP2基因的表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征、組織表達(dá)特異性和過(guò)表達(dá)植株的表型，既有相似之處，但也有不一樣的地方.

在結(jié)構(gòu)方面，雖然NbPAP2與AtPAP2的氨基酸序列同源性為64.2%，但預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)特征與AtPAP2極為相似，如N端的信號(hào)肽、C端的強(qiáng)疏水性基序和葉綠體靶向.當(dāng)然，研究顯示AtPAP2實(shí)際上是葉綠體和線粒體雙定位[15]，NbPAP2是否同樣靶向線粒體則還有待進(jìn)一步證實(shí).

在組織表達(dá)特異性方面，雖然NbPAP2在各組織中都被檢測(cè)到表達(dá)，成熟組織中的表達(dá)略高于幼嫩組織，但表達(dá)豐度最高的組織卻是花瓣，這與AtPAP2的表達(dá)模式存在差異.同時(shí)，考慮到通常情況下花瓣并非植物進(jìn)行光合作用的器官，因此這暗示NbPAP2可能還有促進(jìn)光合作用之外的其它功能.Guo等人的研究顯示，充足的糖分對(duì)花色素的合成有促進(jìn)作用[16-17]，因此NbPAP2很可能在本氏煙花色的形成中發(fā)揮著重要的作用.

在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型方面，過(guò)表達(dá)AtPAP2和NbPAP2均促進(jìn)花期提前，同時(shí)種產(chǎn)量增加.不過(guò)值得注意的是，前者產(chǎn)量的增加是種子數(shù)量和質(zhì)量共同增加的結(jié)果，但過(guò)表達(dá)NbPAP2并沒(méi)有增加轉(zhuǎn)基因植株的種子數(shù)量，產(chǎn)量增加僅僅是由于種子質(zhì)量增加所致.同樣，過(guò)表達(dá)NbPAP2雖然促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的光合作用以及蔗糖合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，但葉片中蔗糖的含量反而降低，并且降低的程度與基因表達(dá)的水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.類似的結(jié)果在亞麻芥中有相關(guān)報(bào)道[18].一般來(lái)說(shuō)，葉片中蔗糖的含量是由SPS控制下的蔗糖合成速率、葉片輸出速率和光合作用速率共同決定的[19-20].較高的光合速率和SPS數(shù)量及活性導(dǎo)致蔗糖的增加，高效的蔗糖輸出速率則會(huì)降低蔗糖的水平.因此在過(guò)表達(dá)AtPAP2的亞麻芥和過(guò)表達(dá)NbPAP2的本氏煙中，葉蔗糖含量降低可能是蔗糖高效運(yùn)輸大于光合速率及蔗糖合成速率的結(jié)果.蔗糖含量的降低可以減輕高濃度蔗糖對(duì)光合作用和SPS活性的反饋抑制，進(jìn)一步促進(jìn)碳固定，并進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速率提升、早花及種子產(chǎn)量提高.

還需要指出的是，過(guò)表達(dá)PAP2類的基因都促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植物種子體積和質(zhì)量的增加，這對(duì)于以種子為目標(biāo)產(chǎn)品的植物無(wú)疑是有益的.但是對(duì)于茄科的番茄、辣椒、茄子、枸杞等這些以整個(gè)果實(shí)而非種子為產(chǎn)品的植物，在應(yīng)用該策略時(shí)需要考慮到種子過(guò)大對(duì)食物口感的影響.